{"id":4903,"date":"2024-01-15T06:33:58","date_gmt":"2024-01-15T06:33:58","guid":{"rendered":"https:\/\/corp.farlong.com\/protective-effect-of-tisochrysis-lutea-on-dry-eye-syndrome-via-nf-%ce%bab-inhibition\/"},"modified":"2024-01-27T10:30:56","modified_gmt":"2024-01-27T10:30:56","slug":"protective-effect-of-tisochrysis-lutea-on-dry-eye-syndrome-via-nf-%ce%bab-inhibition","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/directcm.com\/es\/protective-effect-of-tisochrysis-lutea-on-dry-eye-syndrome-via-nf-%ce%bab-inhibition\/","title":{"rendered":"Efecto protector de Tisochrysis lutea sobre el s\u00edndrome del ojo seco mediante la inhibici\u00f3n de NF-\u03baB"},"content":{"rendered":"
\n

Materiales<\/h3>\n

Materiales in vivo\/in vitro<\/h4>\n

T. lutea<\/i> se obtuvo de Microalgae Ask Us Corp. (Gangneung, Corea). La escopolamina, la fluoresce\u00edna y la hematoxilina y eosina (H&E) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) para experimentos con animales. El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): F12, la soluci\u00f3n salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), el suero bovino fetal (FBS) y la soluci\u00f3n de tripsina-EDTA 0,251 TP3T se obtuvieron de Life Technologies (Carlsbad, CA, EE. UU.). La soluci\u00f3n antibi\u00f3tica, que comprende 10.000 U\/ml de penicilina y 10.000 \u03bcg\/ml de estreptomicina, se adquiri\u00f3 de Hyclone Laboratories Inc. (South Logan, UT, EE. UU.). El TNF-\u03b1 humano recombinante se obtuvo de sistemas de I+D (Minneapolis, MN, EE. UU.). Los anticuerpos primarios que incluyen la quinasa regulada por se\u00f1ales extracelulares (ERK), la quinasa N-terminal anti-c-jun (JNK), anti-p38, anti-\u03b1-tubulina y anti-\u03b2-actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, California, EE.UU.). Otros anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de r\u00e1bano picante (HRP) se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA, EE. UU.). Los productos qu\u00edmicos, incluido el bromuro de 3\u20134,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).<\/p>\n

Materiales de an\u00e1lisis qu\u00edmico.<\/h3>\n

Los PUFA se identificaron utilizando una soluci\u00f3n que conten\u00eda 37 sustancias est\u00e1ndar de PUFA, adquirida en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El \u00e1cido val\u00e9rico se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) para usarlo como est\u00e1ndar interno. Disolventes, incluida la soluci\u00f3n de trifluoruro de boro y metanol, norte<\/i>-hexano, Na2<\/sub>ENTONCES4<\/sub>, CH3<\/sub>Cl, MeOH y NaCl, utilizados para extraer PUFA de T. lutea<\/i> se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).<\/p>\n

Declaraci\u00f3n \u00e9tica<\/h3>\n

Esta investigaci\u00f3n fue aprobada por el Comit\u00e9 Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto Coreano de Ciencia y Tecnolog\u00eda (KIST): KIST No. 2020-002, Instituto Gangneung, y sigui\u00f3 la declaraci\u00f3n de la Asociaci\u00f3n para la Investigaci\u00f3n en Visi\u00f3n y Oftalmolog\u00eda sobre la Uso de animales en investigaciones oft\u00e1lmicas y de la visi\u00f3n. Adem\u00e1s, seguimos las recomendaciones de Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con las regulaciones y directrices aplicables.<\/p>\n

Experimentos con animales e inducci\u00f3n del modelo DES.<\/h3>\n

Los ratones se alojaron en una habitaci\u00f3n para animales con aire acondicionado y se mantuvieron a 22 \u00b0C \u00b1 2 \u00b0C, 50% \u00b1 10% de humedad y un ciclo circadiano de 12 h de luz\/12 h de oscuridad. Se proporcion\u00f3 agua y comida ad libitum. Los ratones se aclimataron durante una semana antes de dividirlos aleatoriamente en cinco grupos de siete ratones BALB\/c machos de 6 semanas de edad (Orientbio, Gyunggi-do, Corea). El DES se indujo experimentalmente en ratones dos veces al d\u00eda mediante inyecci\u00f3n intraperitoneal de 200 \u03bcl (2,5 mg\/ml) de escopolamina diluida en soluci\u00f3n salina tamponada con fosfato (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). T. lutea<\/i> se administr\u00f3 por v\u00eda oral a grupos de ratones diariamente en concentraciones de 0 (control del veh\u00edculo), 100, 150 o 300 mg\/kg en 200 \u03bcL de agua destilada. El grupo de control recibi\u00f3 PBS sin escopolamina. Cuando T. lutea<\/i> se administr\u00f3 por v\u00eda oral, en el grupo control y DES se utilizaron 200 \u03bcL de agua destilada. La producci\u00f3n de l\u00e1grimas se cuantific\u00f3 despu\u00e9s de dos semanas utilizando una tira reactiva de Schirmer est\u00e1ndar colocada en el tercio inferior del p\u00e1rpado temporal antes de cerrar el ojo durante 1 minuto. Luego se retir\u00f3 la tira y se midi\u00f3 la longitud del punto h\u00famedo en mil\u00edmetros para determinar el valor de la prueba de Schirmer. Se utiliz\u00f3 tinci\u00f3n de la superficie corneal para determinar el alcance de los cambios en la superficie corneal. Se observ\u00f3 y calific\u00f3 la superficie corneal despu\u00e9s de inyectar una gota de fluoresce\u00edna 3% en la conjuntiva lateral inferior. La tinci\u00f3n corneal se evalu\u00f3 a ciegas. Los ratones fueron sacrificados mediante dislocaci\u00f3n cervical. Las c\u00f3rneas se extrajeron moviendo el p\u00e1rpado del rat\u00f3n y usando unas pinzas para cortar el nervio \u00f3ptico del globo ocular y extraer la c\u00f3rnea. El cristalino se extrajo del interior de la c\u00f3rnea y se almacen\u00f3 a -80 \u00b0C. Se extrajo la gl\u00e1ndula lagrimal de la mand\u00edbula inferior del rat\u00f3n con unas pinzas y se cort\u00f3 la epidermis del \u00e1rea extra\u00edda para revelar la mitad inferior de la cara. La gl\u00e1ndula lagrimal cerca de la mand\u00edbula inferior se asegur\u00f3 y se extrajo y luego se almacen\u00f3 a -80 \u00b0C protegida de la luz.<\/p>\n

Histolog\u00eda<\/h3>\n

Los tejidos de la epidermis corneal y de las gl\u00e1ndulas lagrimales se recogieron y fijaron en formaldeh\u00eddo 10%, seguido de procesamiento para inclusi\u00f3n en parafina y corte. Las secciones se ti\u00f1eron con H&E y se examinaron con un aumento de 40 \u00d7 utilizando un microscopio (TE-2000U, Nikon, Tokio, Jap\u00f3n). El espesor del epitelio corneal central se determin\u00f3 dividiendo cada c\u00f3rnea en cinco secciones.<\/p>\n

Tinci\u00f3n DAB para an\u00e1lisis inmunohistoqu\u00edmico (IHC)<\/h3>\n

Se tomaron tejidos de las gl\u00e1ndulas lagrimales de ratones BALB\/c y se fijaron con formaldeh\u00eddo 10%. Los tejidos de las gl\u00e1ndulas lagrimales fijadas se incluyeron en parafina, se seccionaron (5 \u03bcm) y la parafina se elimin\u00f3 tres veces durante 3 minutos usando xileno (Junsei, Tokio, Jap\u00f3n). Las secciones se hidrataron durante 1 min en etanol 100, 95, 70 y 50%. El ant\u00edgeno de la gl\u00e1ndula lagrimal se extrajo por microondas con tamp\u00f3n TRIS-EDTA (pH 9,0). Despu\u00e9s de aplicar per\u00f3xido de hidr\u00f3geno 3% a portaobjetos de tejido durante 15 minutos, las secciones se bloquearon con 2% BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se trataron durante la noche a 4 \u00b0C con CD45 (Bio-RAD, MCA 1258GT, diluci\u00f3n 1:100). Despu\u00e9s de lavar con PBS, las c\u00e9lulas se trataron durante 2 h a temperatura ambiente con IgG-HRP anti-conejo (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., SC-2357, diluci\u00f3n 1:100) y se ti\u00f1eron durante 1 min con 3, Tetraclorhidrato de 3\u2032-diaminobencidina (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Los portaobjetos se ti\u00f1eron durante 30 s con hematoxilina y se enjuagaron con agua del grifo. Luego se cubrieron las rodajas y se montaron con medio de montaje Permount\u2122 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Todos los portaobjetos fueron examinados y fotografiados utilizando un microscopio \u00f3ptico (Olympus, CX43, Olympus Optical Co., Tokio, Jap\u00f3n). Software ImageJ (versi\u00f3n 1.53, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.)48<\/a><\/sup> se utiliz\u00f3 para realizar an\u00e1lisis de datos cuantitativos.<\/p>\n

Cultivo celular ARPE-19<\/h3>\n

Se cultivaron c\u00e9lulas ARPE-19 epiteliales de la retina humana (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) en medio DMEM\/F-12 (Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.) suplementado con 10% FBS (HyClone Laboratories, Logan, UT). , EE. UU.) y penicilina\/estreptomicina 1% (HyClone Laboratories). Las c\u00e9lulas se sembraron a una densidad de 2 \u00d7 105<\/sup> por pocillo en placas de 6 pocillos y se cultivan para inducir una respuesta inflamatoria y endopl\u00e1smica.<\/p>\n

Viabilidad celular<\/h3>\n

El efecto de T. lutea<\/i> La viabilidad celular se evalu\u00f3 mediante el ensayo MTT como se describe en el estudio anterior.49<\/a><\/sup> pero con ligeras modificaciones. Las c\u00e9lulas se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 1,5 x 104<\/sup> c\u00e9lulas\/pozo y se incubaron durante 24 h. Luego las c\u00e9lulas fueron tratadas con varias concentraciones de T. lutea<\/i> y se incuba durante 24 h m\u00e1s. El sobrenadante de cada pocillo se reemplaz\u00f3 con un medio de crecimiento nuevo que conten\u00eda 0,5 mg\/ml de MTT y se incub\u00f3 durante 1 h. Se elimin\u00f3 el sobrenadante y los dep\u00f3sitos de formaz\u00e1n generados se disolvieron en 200 \u03bcL de dimetilsulf\u00f3xido. La absorbancia se midi\u00f3 a 570 nm. La viabilidad celular se calcul\u00f3 relativamente como porcentaje en comparaci\u00f3n con los grupos de control negativo.<\/p>\n

An\u00e1lisis de Western Blot<\/h3>\n

Se realiz\u00f3 una transferencia Western para determinar las v\u00edas de se\u00f1alizaci\u00f3n celular subyacentes al efecto antiinflamatorio de T. lutea<\/i> como se describe en el estudio anterior49<\/a><\/sup>, pero con peque\u00f1as modificaciones. Las c\u00e9lulas ARPE-19 confluentes se privaron de DMEM:F12 que conten\u00eda 1% FBS y antibi\u00f3ticos 1% durante 24 h. Luego las c\u00e9lulas fueron tratadas con T. lutea<\/i> (50 y 100 \u03bcg\/mL) durante 2 h y luego se estimularon con 20 ng\/mL de TNF-\u03b1 durante 15 min. Las c\u00e9lulas se enjuagaron tres veces con DPBS helado y luego se lisaron en un tamp\u00f3n de extracci\u00f3n de prote\u00ednas (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corea) complementado con un c\u00f3ctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa. Los sobrenadantes de los lisados se obtuvieron por centrifugaci\u00f3n (14.000 \u00d7gramo<\/i>, 30 min, 4 \u00b0C) y su concentraci\u00f3n de prote\u00ednas se estim\u00f3 utilizando un kit de ensayo de prote\u00ednas DCTM (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Se separaron cantidades iguales (15 a 25 \u03bcg) de prote\u00ednas celulares mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se incubaron con alb\u00famina s\u00e9rica bovina 5% o leche desnatada y luego se incubaron con una diluci\u00f3n 1:2000 de anticuerpos primarios (anti-phopho-ERK, anti-ERK, anti-fosfo-JNK, anti-JNK, anti-fosfo-p38 , acci\u00f3n anti-p38, anti-fosfo-AKT, anti-AKT, anti-fosfo-I\u03baB-\u03b1, anti-I\u03baB-\u03b1, anti-fosfo-p65, anti-p65, anti-\u03b1-tubulina y anti-\u03b2 ) a 4 \u00b0C y 12 h. Luego, las membranas se enjuagaron con TBS-T y se trataron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con HRP a una diluci\u00f3n de 1:10.000. Las bandas de prote\u00ednas se detectaron utilizando el sustrato de m\u00e1xima sensibilidad SuperSignal West Femto (Thermo Fisher Scientific) y se visualizaron en un sistema de documentaci\u00f3n de gel iBright CL1000 (Thermo Fisher Scientific). La densidad de cada transferencia de prote\u00edna se determin\u00f3 utilizando el software Image J (versi\u00f3n 1.53, NIH)48<\/a><\/sup>.<\/p>\n

Extracci\u00f3n total de PUFA de T. lutea<\/i><\/h3>\n

Los PUFA totales se extrajeron de T. lutea<\/i> utilizando la t\u00e9cnica de Folch50<\/a><\/sup>. Brevemente, se colocaron 100 mg de la muestra en un vial que conten\u00eda 5 ml de CH3<\/sub>Soluci\u00f3n de Cl:MeOH (2:1, v\/v) y se ultrasonic\u00f3 durante 15 min. La suspensi\u00f3n se clarific\u00f3 mediante centrifugaci\u00f3n a 10.000 rpm durante 5 min. N \/ A2<\/sub>ENTONCES4<\/sub> Se a\u00f1adi\u00f3 al sobrenadante que luego se filtr\u00f3 para eliminar el agua restante. Este paso se repiti\u00f3 dos veces m\u00e1s. Luego, la soluci\u00f3n se concentr\u00f3 bajo nitr\u00f3geno gaseoso para obtener l\u00edpidos de algas puros.<\/p>\n

Metilaci\u00f3n de \u00e1cidos grasos<\/h3>\n

Se llev\u00f3 a cabo la metilaci\u00f3n de \u00e1cidos grasos para preparar muestras de l\u00edpidos para el an\u00e1lisis por cromatograf\u00eda de gases (GC). El material extra\u00eddo se a\u00f1adi\u00f3 a un vial de 10 ml seguido de 1 ml de una mezcla de NaOH:MeOH 0,5 N. Esta soluci\u00f3n contiene 400 \u03bcg\/ml de cadena interna (\u00e1cido val\u00e9rico). La mezcla se agit\u00f3 durante 30 s y luego se incub\u00f3 durante 20 min a 80 \u00b0C. Luego se enfri\u00f3 la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min y luego se agregaron 2 ml de trifluoruro de boro:MeOH y luego se agit\u00f3 durante 30 s. La mezcla se incub\u00f3 durante 20 min a 80 \u00b0C y luego se enfri\u00f3 durante 10 min. Se a\u00f1adi\u00f3 un volumen de 2 ml de NaCl sobresaturado para inducir la separaci\u00f3n de fases y la recogida de \u00e1cidos grasos. A continuaci\u00f3n, 1,5 ml de norte<\/i>Se a\u00f1adi\u00f3 -hexano y la mezcla se agit\u00f3 durante 30 s antes de enfriar a temperatura ambiente durante 20 min. Las capas se separaron y el sobrenadante l\u00edquido se elimin\u00f3 de la mezcla y el agua se elimin\u00f3 completamente usando Na saturado.2<\/sub>ENTONCES4<\/sub> filtrar.<\/p>\n

Identificaci\u00f3n de \u00e1cidos grasos.<\/h3>\n

Los \u00e9steres met\u00edlicos de \u00e1cidos grasos (FAME) se examinaron utilizando un GC equipado con un detector de ionizaci\u00f3n de llama (FID; Agilent 7890A, Agilent Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.). Se inyectaron muestras (1 \u00b5l) en la columna HP-88 del GC (J&W 112-88A7, Agilent Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.) (100 m \u00d7 250 \u00b5m ID, pel\u00edcula de 0,2 \u00b5m). El an\u00e1lisis por GC se realiz\u00f3 de la siguiente manera: las muestras se mantuvieron inicialmente a 140 \u00b0C durante 5 minutos, y luego la temperatura se aument\u00f3 a 4 \u00b0C\/min hasta 240 \u00b0C durante 15 minutos. El caudal de la columna se fij\u00f3 en 1 ml\/min. Se emple\u00f3 gas nitr\u00f3geno como gas portador para el an\u00e1lisis, el FID se ajust\u00f3 a 280 \u00b0C y la relaci\u00f3n de divisi\u00f3n fue 30:1. Los FAME se identificaron compar\u00e1ndolos con est\u00e1ndares conocidos. Cada muestra se midi\u00f3 mediante an\u00e1lisis de GC por triplicado.<\/p>\n

an\u00e1lisis estad\u00edstico<\/h3>\n

Todos los datos se analizaron estad\u00edsticamente mediante ANOVA unidireccional con an\u00e1lisis post hoc de Tukey mediante SPSS versi\u00f3n 18.0 (IBM Co., Armonk, NY, EE. UU.). Se realizaron al menos tres r\u00e9plicas independientes para cada experimento.<\/p>\n<\/div>\n

[anuncio_2]<\/p>\n

Enlace fuente <\/a><\/p>","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

The prevalence of dry eye syndrome (DES) has increased worldwide, affecting around 50% of all adults1. DES is a multifactorial ocular surface disease characterized by tear film instability and hyperosmolarity, ocular surface inflammation and damage, neurosensory abnormalities<\/p>","protected":false},"author":1,"featured_media":5363,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"site-sidebar-layout":"default","site-content-layout":"","ast-site-content-layout":"default","site-content-style":"default","site-sidebar-style":"default","ast-global-header-display":"","ast-banner-title-visibility":"","ast-main-header-display":"","ast-hfb-above-header-display":"","ast-hfb-below-header-display":"","ast-hfb-mobile-header-display":"","site-post-title":"","ast-breadcrumbs-content":"","ast-featured-img":"","footer-sml-layout":"","theme-transparent-header-meta":"default","adv-header-id-meta":"","stick-header-meta":"","header-above-stick-meta":"","header-main-stick-meta":"","header-below-stick-meta":"","astra-migrate-meta-layouts":"set","ast-page-background-enabled":"default","ast-page-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-4)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"ast-content-background-meta":{"desktop":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"tablet":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""},"mobile":{"background-color":"var(--ast-global-color-5)","background-image":"","background-repeat":"repeat","background-position":"center center","background-size":"auto","background-attachment":"scroll","background-type":"","background-media":"","overlay-type":"","overlay-color":"","overlay-gradient":""}},"footnotes":""},"categories":[9],"tags":[],"class_list":["post-4903","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","hentry","category-supplements"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/4903","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=4903"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/4903\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":5393,"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/4903\/revisions\/5393"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/media\/5363"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=4903"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=4903"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/directcm.com\/es\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=4903"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}