Effet protecteur de Tisochrysis lutea sur le syndrome de l'œil sec via l'inhibition de NF-κB

Matériaux

Matériaux in vivo/in vitro

T. lutea a été obtenu auprès de Microalgae Ask Us Corp. (Gangneung, Corée). La scopolamine, la fluorescéine, l'hématoxyline et l'éosine (H&E) ont été achetées chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) pour des expérimentations animales. Le milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM): F12, la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), le sérum de veau fœtal (FBS) et la solution de trypsine-EDTA 0, 251 TP3T ont été obtenus auprès de Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). Une solution antibiotique, comprenant 10 000 U/mL de pénicilline et 10 000 µg/mL de streptomycine, a été achetée auprès de Hyclone Laboratories Inc. (South Logan, UT, USA). Le TNF-α humain recombinant a été obtenu auprès de systèmes de R&D (Minneapolis, MN, USA). Les anticorps primaires, notamment la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK), la kinase N-terminale anti-c-jun (JNK), l'anti-p38, l'anti-α-tubuline et l'anti-β-actine, ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, Californie, États-Unis). D'autres anticorps primaires et des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) ont été obtenus auprès de Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA, USA). Des produits chimiques, notamment le bromure de 3–4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Matériel d'analyse chimique

Les AGPI ont été identifiés à l'aide d'une solution contenant 37 substances standard d'AGPI, achetée auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L'acide valérique a été obtenu auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) pour être utilisé comme étalon interne. Solvants, y compris une solution méthanolique de trifluorure de bore, n-hexane, Na₂DONC₄, CH₃Cl, MeOH et NaCl, utilisés pour extraire les AGPI de T. lutea ont été achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Déclaration éthique

Cette recherche a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Institut coréen des sciences et technologies (KIST) : KIST n° 2020-002, Gangneung Institute, et a fait suite à la déclaration de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie sur le Utilisation d'animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. De plus, nous suivons les recommandations de Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE). Toutes les procédures ont été menées conformément aux réglementations et directives applicables.

Expériences animales et induction du modèle DES

Les souris ont été hébergées dans une salle d'animaux climatisée et maintenues à 22 ° C ± 2 ° C, à une humidité de 501 TP3T ± 101 TP3T et à un cycle circadien de 12 h de lumière / 12 h d'obscurité. La nourriture et l'eau étaient fournies ad libitum. Les souris ont été acclimatées pendant une semaine avant d'être divisées au hasard en cinq groupes de sept souris BALB/c mâles âgées de 6 semaines (Orientbio, Gyunggi-do, Corée). Le DES a été induit expérimentalement chez des souris deux fois par jour par injection intrapéritonéale de 200 μL (2,5 mg/mL) de scopolamine diluée dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). T. lutea a été administré quotidiennement par voie orale à des groupes de souris à des concentrations de 0 (véhicule témoin), 100, 150 ou 300 mg/kg dans 200 μL d'eau distillée. Le groupe témoin a reçu du PBS sans scopolamine. Quand T. lutea a été administré par voie orale, 200 μL d’eau distillée ont été utilisés dans le groupe témoin et DES. La production de larmes a été quantifiée après deux semaines à l'aide d'une bandelette de test de Schirmer standard placée dans le tiers inférieur de la paupière temporale avant de fermer l'œil pendant 1 min. La bandelette a ensuite été retirée et la longueur du point humide en millimètres a été mesurée pour déterminer la valeur du test de Schirmer. La coloration de la surface cornéenne a été utilisée pour déterminer l'étendue des modifications de la surface cornéenne. La surface cornéenne a été observée et notée après injection d'une goutte de fluorescéine 3% dans la conjonctivale latérale inférieure. La coloration cornéenne a été évaluée à l'aveugle. Les souris ont été euthanasiées par luxation cervicale. Les cornées ont été retirées en effleurant la paupière de la souris et en utilisant une pince pour couper le nerf optique du globe oculaire et retirer la cornée. Le cristallin a été retiré de la cornée et conservé à - 80 ° C. La glande lacrymale a été retirée de la mâchoire inférieure de la souris à l'aide de pinces et l'épiderme de la zone tirée a été coupé pour révéler la moitié inférieure du visage. La glande lacrymale proche de la mâchoire inférieure a été sécurisée et retirée puis conservée à -80 °C à l'abri de la lumière.

Histologie

Les tissus de l'épiderme cornéen et des glandes lacrymales ont été collectés et fixés dans du formaldéhyde 10%, suivis d'un traitement pour inclusion et section en paraffine. Les coupes ont été colorées avec H&E et examinées avec un grossissement de 40 × à l'aide d'un microscope (TE-2000U, Nikon, Tokyo, Japon). l'épaisseur épithéliale cornéenne centrale a été déterminée en divisant chaque cornée en cinq sections.

Coloration DAB pour analyse immunohistochimique (IHC)

Les tissus des glandes lacrymales de souris BALB/c ont été prélevés et fixés avec du formaldéhyde 10%. Les tissus fixes des glandes lacrymales ont été inclus en paraffine, sectionnés (5 μm) et la paraffine a été retirée trois fois pendant 3 minutes à l'aide de xylène (Junsei, Tokyo, Japon). Les coupes ont été hydratées pendant 1 min dans de l'éthanol 100, 95, 70 et 50%. L'antigène de la glande lacrymale a été extrait par micro-ondes avec un tampon TRIS – EDTA (pH 9,0). Après avoir appliqué du peroxyde d'hydrogène 3% sur des lames de tissus pendant 15 minutes, les coupes ont été bloquées avec du 2% BSA pendant 1 h à température ambiante. Les coupes ont été traitées pendant une nuit à 4 ° C avec CD45 (Bio-RAD, MCA 1258GT, dilution 1: 100). Après lavage avec du PBS, les cellules ont été traitées pendant 2 h à température ambiante avec des IgG-HRP anti-lapin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, SC-2357, dilution 1: 100) et colorées pendant 1 min avec 3, Tétrachlorhydrate de 3′-diaminobenzidine (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Les lames ont été colorées pendant 30 s à l'hématoxyline et rincées à l'eau du robinet. Les tranches ont ensuite été recouvertes d'une lamelle et montées avec le milieu de montage Permount ™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Toutes les lames ont été examinées et photographiées à l'aide d'un microscope optique (Olympus, CX43, Olympus Optical Co., Tokyo, Japon). Logiciel ImageJ (version 1.53, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)⁴⁸ a été utilisé pour effectuer une analyse quantitative des données.

Culture cellulaire ARPE-19

Des cellules épithéliales rétiniennes humaines ARPE-19 (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA) ont été cultivées dans un milieu DMEM/F-12 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) additionné de FBS 10% (HyClone Laboratories, Logan, UT). , USA) et pénicilline/streptomycine 1% (HyClone Laboratories). Les cellules ont été ensemencées à une densité de 2 × 10⁵ par puits dans des plaques à 6 puits et cultivés pour induire une réponse inflammatoire et endoplasmique.

Viabilité cellulaire

L'effet de T. lutea La viabilité cellulaire a été évaluée par le test MTT comme décrit dans l'étude précédente.⁴⁹ mais avec de légères modifications. Les cellules ont été étalées dans des plaques de culture à 96 puits à une densité de 1,5 × 10⁴ cellules/puits et incubé pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec diverses concentrations de T. lutea et incubé pendant 24 h supplémentaires. Le surnageant de chaque puits a été remplacé par un milieu de croissance frais contenant 0,5 mg/mL de MTT et incubé pendant 1 h. Le surnageant a été éliminé et les dépôts de formazan générés ont été dissous dans 200 µL de diméthylsulfoxyde. L'absorbance a été mesurée à 570 nm. La viabilité cellulaire a été relativement calculée en pourcentage par rapport aux groupes témoins négatifs.

Analyse par Western Blot

Un Western blot a été réalisé pour déterminer les voies de signalisation cellulaire sous-jacentes à l'effet anti-inflammatoire de T. lutea comme décrit précédemment dans l'étude⁴⁹, mais avec des modifications mineures. Les cellules confluentes ARPE-19 ont été privées de nourriture dans du DMEM: F12 contenant des antibiotiques 1% FBS et 1% pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été traitées avec T. lutea (50 et 100 µg/mL) pendant 2 h puis stimulée avec 20 ng/mL de TNF-α pendant 15 min. Les cellules ont été rincées trois fois avec du DPBS glacé, puis lysées dans un tampon d'extraction de protéines (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corée) complété par un cocktail d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase. Les surnageants de lysats ont été obtenus par centrifugation (14 000×g, 30 min, 4 ° C) et leur concentration en protéines a été estimée à l'aide d'un kit de dosage de protéines DCTM (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Des quantités égales (15 à 25 µg) de protéines cellulaires ont été séparées par SDS-PAGE et transférées sur des membranes PVDF. Les membranes ont été incubées avec de l'albumine sérique bovine 5% ou du lait écrémé, puis avec une dilution au 1: 2000 d'anticorps primaires (anti-phopho-ERK, anti-ERK, anti-phospho-JNK, anti-JNK, anti-phospho-p38). , anti-p38, anti-phospho-AKT, anti-AKT, anti-phospho-IκB-α, anti-IκB-α, anti-phospho-p65, anti-p65, anti-α-tubuline et anti-β-action ) à 4 °C et 12 h. Les membranes ont ensuite été rincées avec du TBS-T et traitées 1 h à température ambiante avec des anticorps secondaires anti-lapin conjugués à la HRP à une dilution de 1:10 000. Les bandes de protéines ont été détectées à l'aide du substrat de sensibilité maximale SuperSignal West Femto (Thermo Fisher Scientific) et visualisées dans un système de documentation sur gel iBright CL1000 (Thermo Fisher Scientific). La densité de chaque transfert de protéine a été déterminée à l'aide du logiciel Image J (version 1.53, NIH)⁴⁸.

Extraction totale des AGPI de T. lutea

Les AGPI totaux ont été extraits de T. lutea en utilisant la technique Folch⁵⁰. En bref, 100 mg de l'échantillon ont été placés dans un flacon contenant 5 ml de CH₃Solution Cl:MeOH (2:1, v/v) et ultrasoniquée pendant 15 min. La suspension a été clarifiée par centrifugation à 10 000 tr/min pendant 5 min. N / A₂DONC₄ a été ajouté au surnageant qui a ensuite été filtré pour éliminer toute eau restante. Cette étape a été répétée encore deux fois. La solution a ensuite été concentrée sous azote gazeux pour obtenir des lipides d’algues purs.

Méthylation des acides gras

La méthylation des acides gras a été réalisée pour préparer des échantillons de lipides pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse (GC). Le matériau extrait a été ajouté à un flacon de 10 ml, suivi de 1 ml d'un mélange NaOH:MeOH 0,5 N. Cette solution contient 400 μg/mL d'étalon interne (acide valérique). Le mélange a été agité pendant 30 secondes, puis incubé pendant 20 minutes à 80 °C. Le mélange a ensuite été refroidi à température ambiante pendant 5 min, puis 2 ml de trifluorure de bore : MeOH ont été ajoutés, puis agités pendant 30 s. Le mélange a été incubé pendant 20 min à 80 °C suivi d'un refroidissement pendant 10 min. Un volume de 2 ml de NaCl sursaturé a été ajouté pour induire la séparation des phases et la collecte des acides gras. Ensuite, 1,5 ml de nDe l'hexane a été ajouté et le mélange a été vortexé pendant 30 s avant de refroidir à température ambiante pendant 20 min. Les couches ont été séparées et le surnageant liquide a été retiré du mélange et l'eau a été complètement éliminée à l'aide d'un Na saturé.₂DONC₄ filtre.

Identification des acides gras

Les esters méthyliques d'acides gras (FAME) ont été examinés à l'aide d'un GC équipé d'un détecteur à ionisation de flamme (FID ; Agilent 7890A, Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA). Des échantillons (1 µL) ont été injectés dans la colonne HP-88 du GC (J&W 112-88A7, Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) (100 m × 250 µm ID, film de 0,2 µm). L'analyse GC a été réalisée comme suit : les échantillons ont été initialement maintenus à 140 °C pendant 5 min, puis la température a été augmentée à 4 °C/min jusqu'à 240 °C pendant 15 min. Le débit de la colonne a été fixé à 1 mL/min. De l'azote gazeux a été utilisé comme gaz porteur pour l'analyse, le FID a été réglé à 280 °C et le rapport de division était de 30 : 1. Les FAME ont été identifiés en les comparant aux normes connues. Chaque échantillon a été mesuré par analyse GC en triple.

analyses statistiques

Toutes les données ont été analysées statistiquement en utilisant une ANOVA unidirectionnelle avec l'analyse post-hoc de Tukey par SPSS version 18.0 (IBM Co., Armonk, NY, USA). Au moins trois répétitions indépendantes ont été réalisées pour chaque expérience.