Abstrait
Objectif:
Optimiser les conditions d'extraction de la quercitrine et des flavonoïdes totaux (TF) de Herba Polygoni Capitati (Touhualiao en chinois) en utilisant la méthodologie de surface de réponse (RSM).
Matériels et méthodes:
Un plan composite central (CCD) a été adopté pour étudier les effets de trois variables indépendantes, notamment la composition du solvant (%), le rapport solvant-matériau (ml/g) et le temps d'extraction (min) sur les réponses, les rendements en quercitrine et en TF.
Résultats:
Les conditions optimisées de l'extraction sont les suivantes : Concentration en éthanol, 65.63% ; rapport solvant-matériau, 10,55:1 (ml/g) ; temps d'extraction, 54,33 min. Le modèle mathématique établi décrivait bien les facteurs des paramètres expérimentaux et fournissait une prédiction statistiquement précise des rendements optimaux de quercitrine et de TF.
Conclusion:
Les valeurs expérimentales concordaient avec celles prédites par le modèle mathématique établi, indiquant ainsi la pertinence du modèle utilisé et le succès de RSM dans l'optimisation des conditions d'extraction.
INTRODUCTION
Herba Polygoni Capitati, la partie aérienne ou plante entière de Polygone capitatum Buch.-Jambon. ex D. Don, est utilisée depuis longtemps comme l'une des médecines traditionnelles chinoises (MTC) en Chine, en particulier dans certaines régions de minorités ethniques. Les constituants chimiques actifs de Herba Polygoni Capitati ont été identifiés comme étant des flavonoïdes, des acides phénoliques et des tanins,[1,2,3] dans lequel les flavonoïdes étaient considérés comme les principaux composés bioactifs. Des études pharmacologiques et cliniques ont indiqué que la quercétine et ses glucosides étaient des composés bioactifs possédant des propriétés anti-carinogènes.4,5] antioxydant[6,7] et activités de modulation enzymatique.[8,9,10] Des études épidémiologiques montrent également une relation inverse entre un apport élevé en flavonoïdes (principalement quercétine) et les maladies cardiovasculaires.[11]
Les extraits de MTC sont utilisés dans les remèdes traditionnels et les plantes médicinales depuis des siècles à travers le monde.12,13] et de nombreuses expériences précieuses ont été accumulées dans ce système thérapeutique. L'éphédrine, un stimulant de type amphétamine utilisé comme décongestionnant pour les médicaments contre l'asthme, a été extraite et isolée de l'herbe médicinale chinoise. éphédra herbe.[14] L'extrait de Ginkgo biloba, en particulier l'EGb 761 standardisé, était l'un des remèdes à base de plantes les plus largement utilisés pour traiter la démence et les troubles cognitifs.[15] Étant donné que de nombreux facteurs tels que la composition du solvant, le temps d'extraction, la température d'extraction et le rapport solvant-matériau peuvent influencer de manière significative l'efficacité de l'extraction, les paramètres d'extraction doivent être optimisés pour obtenir davantage d'ingrédients ayant une valeur prophylactique ou thérapeutique chez les sujets humains.16]
Parmi tous les composés présentés dans Herba Polygoni Capitati, les acides phénoliques et les composants flavonoïdes ont reçu le plus d'attention et ont été considérés comme importants pour leurs effets pharmacologiques.17] L'extraction de l'acide gallique (GA) ou TF de Herba Polygoni Capitati selon une approche un facteur à la fois seule,[18] ou associé à une conception orthogonale,[19] a déjà été signalé. L'approche un facteur à la fois, dans laquelle un seul facteur est variable à la fois tout en gardant tous les autres facteurs constants,[20] prend du temps et peut conduire à des conclusions trompeuses car il n'inclut pas les effets interactifs entre les facteurs. La conception orthogonale est utile dans la conception de tests[21] mais il n'offre pas de prédiction à partir de l'équation du modèle. La méthodologie des surfaces de réponse (RSM), un ensemble de techniques statistiques et mathématiques, peut surmonter ces inconvénients, car elle prend en compte les effets d'interaction possibles entre les variables.22,23] Le tracé de la surface de réponse et le tracé de contour de la réponse en fonction des paramètres indépendants peuvent être obtenus par RSM.[24] Dans la présente étude, l'approche RSM a été appliquée pour optimiser les conditions d'extraction (proportion de solvant, rapport solvant-matériau, temps d'extraction, etc.) de Herba Polygoni Capitati afin de maximiser les rendements de quercitrine et de TF simultanément.
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Matériaux et produits chimiques
Herba Polygoni Capitati, identifié botaniquement par le professeur Deyuan Chen, a été obtenu auprès de Guizhou Warmen Pharmaceutical Corporation, Guizhou, Chine. La plante entière de Herba Polygoni Capitati a été séchée dans un four universel à convection forcée (101-2AB Taijin, Chine) à 50°C pendant 4 h. L'échantillon séché a été broyé dans un broyeur rotatif (DFY-200 Wenling, Chine) et la poudre a été tamisée. Des particules d'une taille comprise entre 10 et 40 mesh (0,3 ~ 2 mm, ID) ont été collectées pour l'étude. Les composés de référence quercitrine (111538-200403) et rutine (080-9303) ont été achetés auprès de l'Institut national de contrôle des produits biologiques et pharmaceutiques de Chine (Beijing, Chine). L'acétonitrile et le méthanol étaient de qualité HPLC (Tedia, USA). L'eau était de l'eau pure et potable (Le Bai Shi Food and Beverage Ltd., Guangdong). L'acide formique était de qualité MS (Roe Scientific Inc, USA). Tous les autres produits chimiques et solvants étaient de qualité analytique et disponibles dans le commerce.
La préparation des échantillons
La poudre d'Herba Polygoni Capitati de 2 g a été pesée avec précision et extraite dans certaines conditions, puis l'extrait a été centrifugé à 3 500 °C. tr/min pendant 10 mn. Le surnageant a été collecté et filtré sur papier filtre pour une analyse ultérieure.
Appareil
Les systèmes analytiques utilisés dans cette étude étaient les suivants : Les spectres UV-Vis ont été enregistrés sur un spectrophotomètre double faisceau (Cary 100-Varian) avec des cellules de 1 cm de trajet. Un système UHPLC-DAD DIONEX / UltiMate série 3000 composé d'un dégazeur sous vide, d'une pompe quaternaire, d'un échantillonneur automatique, d'un compartiment de colonne thermostatique et d'un détecteur DAD (DIONEX, ThermoFisher, Sunnyvale, USA) a été utilisé pour l'acquisition de chromatogrammes.
Détermination de la teneur totale en flavonoïdes
La teneur totale en flavonoïdes (TFC) a été déterminée selon la méthode colorimétrique à l'aluminium décrite précédemment.25,26,27,28] avec modifications. En bref, une aliquote (0,5 ml) de chaque extrait de plante a été mélangée à 4,3 ml de solvant associé, suivi de l'ajout de 0,1 ml de chlorure d'aluminium 10% (AlCl3) et 0,1 ml d'acétate de sodium 1M (CH3 COONa). La rutine a été utilisée comme étalon de référence. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante, le mélange réactionnel a été mesuré à 405 nm par rapport à un blanc. La valeur TFC de chaque échantillon a été calculée et exprimée en milligrammes d'équivalents rutine par gramme de matière séchée (MS).
Séparation chromatographique
Les analyses HPLC des extraits ont été effectuées en utilisant la série DIONEX/UltiMate 3000. La séparation a été réalisée sur un ZORBAX SB-C18 colonne (150 mm × 4,6 mm, 5 μm ; Agilent, CA, USA) avec un débit de 1,0 ml/min. La phase mobile était constituée d'une combinaison de A (acétonitrile) et de B (acide formique 0,21 TP3T dans l'eau). Le gradient linéaire était de 5% à 15% A (v/v) à 5 min, à 16% A à 10 min, à 20% A à 20 min et a ensuite été maintenu à 20% A à 22 min. Chaque analyse a été suivie d'un temps d'équilibrage de 5 minutes. La longueur d'onde du détecteur UV a été réglée à 260 nm et la température du four à colonne a été maintenue à 30°C. Les échantillons ont été filtrés avant l'injection (filtre de seringue en PTFE ; 0,45 µm ; Hanbon Ltd, Chine ; 013045). Les données ont été collectées et analysées avec le logiciel Chromeleon 7.1.
Préparation de solutions étalons
Des solutions mères étalons de rutine et de quercitrine ont été préparées dans du méthanol, à des concentrations de 190,8 µg/ml et 106,0 µg/ml, respectivement. La courbe standard de la quercitrine et du TF a été étalonnée en utilisant l'équation de régression linéaire des moindres carrés dérivée de la surface du pic et de l'absorbance, respectivement, les concentrations de quercitrine et de TF dans les échantillons ont été calculées selon la courbe standard.
Sélection des conditions d'extraction appropriées
Avant le développement de l'étude utilisant RSM, un ensemble de tests préliminaires ont été effectués pour sélectionner les variables indépendantes pertinentes et déterminer leurs plages expérimentales. La première étape de l’expérience préliminaire consistait à sélectionner une méthode d’extraction appropriée pour Herba Polygoni Capitati. Trois approches différentes, à savoir la macération, le reflux et l'extraction par sonication, ont été testées. La deuxième étape de l'expérience préliminaire consistait à sélectionner un solvant d'extraction approprié pour Herba Polygoni Capitati. En utilisant une série de solvants d’extraction variant dans la plage de 0 à 1 001 TP3T (éthanol ou méthanol dans l’eau), le meilleur solvant a été déterminé. Troisièmement, le facteur du rapport solvant-matériau (6:1, 8:1, 10:1, 12:1, 14:1 ; v/m) lors de l'extraction a été étudié en utilisant de l'éthanol : eau (70:30, v/v) comme solvant sous condition d'extraction par sonication pendant 30 min à température ambiante. Quatrièmement, une taille de particule appropriée a été sélectionnée pour une étude plus approfondie. Enfin, la durée d'extraction (10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min) a également été testée.
Sur la base de ces résultats, trois niveaux (inférieur, moyen, supérieur) de chaque variable pertinente ont été sélectionnés pour le plan composite central (CCD) afin d'analyser le modèle de réponse et d'établir un modèle.
analyses statistiques
Les données expérimentales obtenues à partir des procédures CCD ont été analysées à l'aide de RSM pour ajuster le modèle polynomial du second ordre suivant (équation (1) et les coefficients de régression obtenus.
Où X1, X2,…, Xk sont les variables indépendantes codées affectant la réponse Y ; β0, βje (je = 1, 2,…, k), βii (i = 1, 2,…, k) et βje (i = 1, 2,…, k) sont les coefficients de régression pour les termes d'origine, linéaires, quadratiques et d'interaction, respectivement ; k est le nombre de variables.
Le logiciel Design Expert version 8.0.5b (STAT-EASE Inc.) a été utilisé pour la régression et l'analyse graphique des données expérimentales. La qualité de l'adéquation du modèle a été évaluée à l'aide des coefficients de détermination (R.2) et analyse de variance (ANOVA). Les surfaces de réponse et les tracés de contour ont été développés à l'aide de l'équation polynomiale quadratique ajustée.
RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
Précision du système, linéarité de HPLC ou UV-Vis
La quercitrine et le TF ont été désignés comme marqueurs pour l'évaluation de l'efficacité de l'extraction. Les profils HPLC de l'étalon de référence et de l'extrait de Herba Polygoni Capitati ont été présentés dans Figure 1. La courbe d'étalonnage de la surface du pic en fonction du niveau de quercitrine a été oui = 47.622 X − 0,2231 avec une plage linéaire de 0,033 à 1,06 μg (R.2 = 1.0000, oui = surface du pic et X = quantité de quercitrine). La courbe d'étalonnage de l'absorbance en fonction de la quantité de TF a été oui = 0.0029 X – 0,0088 avec une plage linéaire de 74,32 à 267,12 μg (R.2 = 0.9996, oui = absorbance et X = montant du TF).
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Chromatogrammes HPLC du composé de référence authentifié de la quercitrine (a) et de l'extrait de Herba Polygoni Capitati (b) à 260nm
Détermination des paramètres et sélection des niveaux
Effet des méthodes d'extraction
Trois méthodes d'extraction différentes, dont la macération, le reflux et l'extraction par sonication, ont été testées avec les valeurs de paramètres suivantes : taille des particules, 10 mesh ; rapport solvant-matériau, 10:1 (ml/g) ; durée d'extraction, 30 min pour l'extraction par reflux et sonication, 12h pour l'extraction par macération ; composition de solvant, éthanol aqueux 70% ; température, température ambiante. La quantité de quercitrine et de TF extraite par gramme de MS a été présentée en Figure 2. L'ANOVA pour les résultats expérimentaux a montré des différences significatives entre ces trois méthodes d'extraction (P. < 0,01). Pendant ce temps, la méthode d’extraction par sonication a donné les rendements les plus élevés de quercitrine et de TF, elle a donc été sélectionnée comme méthode d’extraction.
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Effet de différentes méthodes d'extraction de la quercitrine (à gauche) et du TF (à droite) de Herba Polygoni Capitati
Effet des solvants d'extraction
Le solvant est un facteur clé affectant la récupération des analytes. Dans la présente étude, de l’eau, différentes concentrations de méthanol et différentes concentrations d’éthanol ont été testées. Comme représenté sur la figure 3, l'efficacité d'extraction de l'éthanol aqueux 60% était la plus élevée. Par conséquent, les éthanols 50%, 60% et 70% ont été sélectionnés comme niveaux inférieur, moyen et supérieur de la composition du solvant pour une enquête RSM plus approfondie.
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Influence de la composition du solvant sur l'extraction assistée par ultrasons de la quercitrine et du TF de Herba Polygoni Capitati
Rapports solvant-matériau
L'impact des ratios solvant-matériau sur l'extraction a été testé avec cinq valeurs (6:1, 8:1, 10:1, 12:1, 14:1 ; v/m). Une valeur appropriée du rapport solvant-matériau serait sélectionnée sur la base des règles [29] que la valeur ne doit être ni trop faible (les composés bioactifs ne peuvent pas être entièrement extraits) ni trop élevée (le coût de traitement serait insupportable). Tel que présenté dans Figure 4, une tendance à la hausse des rendements en quercitrine et en TF a été observée, atteignant les valeurs les plus élevées lorsque le rapport était d'environ 10 : 1. Une explication probable était qu'une augmentation du rapport solvant-matériau pouvait augmenter la diffusivité du solvant dans les cellules et améliorer la désorption des composés phénoliques des cellules.30] Dans la présente étude, une légère diminution des rendements en quercitrine et en TF a été observée lorsque la valeur du rapport était supérieure à 10 : 1, ce qui pourrait être dû à une perte plus importante dans la collecte de produits ou dans l'exploitation du processus. Par conséquent, le rapport solvant-matériau a été fixé à 10 : 1 comme niveau intermédiaire pour le RSM dans une étude ultérieure.
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Effet du rapport solvant-matériau sur le rendement en quercitrine et TF
Effet de la taille des particules
La taille des particules est une autre variable importante à prendre en compte. Généralement, l’efficacité de l’extraction augmente avec la diminution de la taille des particules [Figure 5]. Dans la présente étude, la taille des particules a été fixée à 0,45-0,9 mm de diamètre.
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Effet de la taille des particules sur le rendement en quercitrine et TF
Effet du temps d'extraction
La sélection d'un temps d'extraction approprié était la dernière étape de notre étude préliminaire. Différentes durées d'extraction à 10, 20, 30, 40, 50 et 60 min ont été testées pour examiner la valeur optimale. Les résultats ont montré que les rendements en quercitrine et en TF augmentaient avec l'allongement du temps d'extraction de 10 à 50 min.Figure 6]. Au niveau de 50 min, les rendements en quercitrine et en TF ont atteint le montant le plus élevé. Par conséquent, 40, 50 et 60 minutes ont été sélectionnées comme niveaux inférieur, moyen et supérieur de temps d’extraction.
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Effet du temps d'extraction sur le rendement en quercitrine et TF
Optimisation des paramètres d'extraction par RSM
Résultats de régression linéaire multiple et analyse de l'adéquation du modèle ajusté
Un CCD rotatif à trois facteurs et trois niveaux composé de 20 séries expérimentales a été utilisé avec 6 répétitions au point central. Les effets de la variabilité inexpliquée ont été minimisés en randomisant l'ordre des expériences. Les variables indépendantes étaient la composition du solvant (X1, %, v/v, éthanol/eau), le rapport solvant-matériau (X2, ml/g) et le temps d'extraction (X3, min) avec les rendements de quercitrine et de TF comme indicateurs. Une taille de particule fixe (0,45-0,9 mm) a été choisie. Les rendements en quercitrine et TF de toutes les analyses sont indiqués dans Tableau 1. Les régressions linéaires multiples utilisant le modèle polynomial du second ordre (équation (1)) ont été réalisées sur la base de ces résultats.
Tableau 1
Paramètre de conception composite central rotatif dans la forme originale et codée des variables indépendantes (X1, X2, X3) et résultats expérimentaux pour les variables de réponse, quercitrine et TF
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Une ANOVA de variables indépendantes présentée dans Tableau 2 indique que ces trois variables indépendantes affectent de manière significative l’efficacité de l’extraction (P. < 0,05). Les paramètres de régression des modèles quadratiques ajustés avec les coefficients correspondants de déterminations multiples (R.2) ont été présentés dans Tableau 3. De bons ajustements ont été obtenus et la variabilité de la réponse a été expliquée par le modèle. Le haut R.2 les valeurs, 0,94 et 0,96 pour la quercitrine et le TF, respectivement, impliquent que les données expérimentales confirment la compatibilité avec les données prédites par le modèle. La faible valeur du coefficient de variation (1,92% pour la quercitrine, 3,28% pour TF) indique que les résultats obtenus à partir du modèle ajusté étaient fiables. Le coefficient de détermination ajusté (R.2 Adj.) valeur reconstruit l'expression avec tous les *termes significatifs inclus et la valeur élevée du R.2 Adj. (R.2 Adj. est égal à 87%, 92%, respectivement) confirme l'importance du modèle.
Tableau 2
Analyse de variance pour le modèle quadratique de surface de réponse
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Tableau 3
Coefficients de régression du modèle prédit de second ordre pour les variables de réponse, quercitrine et TF
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Les tests de manque d'ajustement ont été utilisés pour vérifier l'adéquation de l'adéquation du modèle. L'ANOVA pour le test de manque d'ajustement n'était pas significative en ce qui concerne les rendements en quercitrine et en TF (P. > 0,05), indiquant que le modèle pourrait s'adapter adéquatement aux données expérimentales [Tableau 4].
Tableau 4
Analyse de variance pour le manque de test d'ajustement pour la quercitrine et le TF
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Analyse des surfaces de réponse
Depuis; les modèles montrent de bons ajustements, les valeurs de réponse sont suffisamment expliquées par l'équation de régression. Les courbes de surface de réponse ont été tracées pour démontrer les interactions des variables indépendantes et pour déterminer la valeur optimale de chaque variable indépendante pour la réponse maximale. La relation entre les variables indépendantes et dépendantes a été illustrée par des tracés de surface de réponse tridimensionnels (3D) et des tracés de contours bidimensionnels (2D). La surface de réponse 3D et les tracés de contour 2D ont été fournis sous forme de représentations graphiques de l'équation de régression [Figures [Figures77 et et8].8]. Chaque courbe de niveau représentait un nombre infini de combinaisons de deux variables indépendantes tout en gardant l'autre variable indépendante au point stationnaire. De cette façon, une surface de réponse 3D peut être facilement visualisée. Figure 7a montre la fonction de surface de réponse 3D développée par le modèle pour la composition du solvant et le rapport solvant-matériau. La composition du solvant a démontré des effets quadratiques sur la réponse. La teneur en quercitrine atteint la valeur la plus élevée lorsque l'éthanol 65% est utilisé. De même, le rapport solvant-matériau a démontré simultanément des effets quadratiques sur la quercitrine. Les résultats des effets de la composition du solvant et du rapport solvant-matériau sur les TF sont présentés dans Figure 8a. La composition du solvant a montré un effet quadratique sur la réponse, produisant un maximum entre 60% et 70% d'éthanol. De même, lorsque la composition du solvant était fixée avec une augmentation du rapport solvant-matériau, TF augmentait progressivement et atteignait la valeur la plus élevée lorsque le rapport solvant-matériau était d'environ 10:1.
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Courbes de surface de réponse (a, c et e) et courbes de contour (b, d et f) montrant l'effet de la composition du solvant (X1), du rapport solvant-matériau (X2) et du temps d'extraction (X3) sur le rendement en quercitrine.
![Un fichier externe contenant une image, une illustration, etc. Le nom de l'objet est PM-10-57-g013.jpg An external file that holds a picture, illustration, etc.Object name is PM-10-57-g013.jpg](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4047582/bin/PM-10-57-g013.jpg)
Courbes de surface de réponse (a, c et e) et courbes de contour (b, d et f) montrant l'effet de la composition du solvant (X1), du rapport solvant-matériau (X2) et du temps d'extraction (X3) sur le rendement en TF.
Les effets des variables indépendantes sur la composition du solvant et le temps d'extraction sur les valeurs de réponse des rendements de quercitrine et de TF sont présentés dans les figures. Figures7c,7c, ,7j,7j, ,8c,8c, ,8d,8j, respectivement. La relation interactive entre les deux variables indépendantes peut être facilement comprise en examinant les tracés de contour générés en gardant constante l'autre variable indépendante, le rapport solvant-matériau, au point stationnaire [Figures [Figures7d7j et et8d].8j]. Une augmentation des rendements en quercitrine et en TF a été obtenue de manière significative avec l'augmentation de la composition du solvant et du temps d'extraction. Cependant, les rendements en quercitrine et en TF n'augmentent plus lorsque les variables indépendantes dépassent certaines valeurs. L'interaction entre la composition du solvant et le temps d'extraction n'était pas statistiquement significative pour affecter le rendement en quercitrine, mais elle avait un effet significatif (P. < 0,01) effet sur l'extraction du TF.
Les figures Chiffres7e7e et et8e8e démontré l'effet du rapport solvant-matériau et du temps d'extraction sur les rendements en quercitrine et en TF. Des augmentations des rendements en quercitrine et en TF ont été observées avec l'augmentation du temps d'extraction et du rapport solvant-matériau, ce qui suggère que les rendements d'extraction de quercitrine et de TF étaient proportionnels au temps d'extraction et au rapport solvant-matériau. L'interaction des deux variables indépendantes lors de l'extraction de la quercitrine et du TF de Herba Polygoni Capitati n'était pas statistiquement significative.
Expériences de vérification
Afin de vérifier la capacité prédictive du modèle, les variables de réponse optimales ont été testées dans les conditions optimisées dérivées de l'analyse des crêtes du RSM. En conséquence, les valeurs observées pourraient être atteintes de manière satisfaisante dans l’intervalle de confiance 95% des valeurs prédites du modèle [Tableau 5].
Tableau 5
Comparaison entre la valeur prédite et la valeur observée pour les variables de réponse, quercitrine et TF
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CONCLUSIONS
En utilisant une approche un facteur à la fois couplée au CCD, les paramètres d'extraction assistés par ultrasons, notamment la composition du solvant, le rapport solvant-matériau et le temps d'extraction, ont été optimisés pour l'extraction de la quercitrine et du TF de Herba Polygoni Capitati. Les résultats ont montré que le modèle polynomial du second ordre donnait une description satisfaisante des données d'extraction. Les conditions optimisées sont les suivantes : Méthode d'extraction, extraction par sonication ; solvant, il pourrait être bon d'arrondir à 65% éthanol aqueux ; taille des particules, 0,45-0,9 mm ; rapport solvant-matériau, rond à 10:1 ; temps d'extraction, arrondir à 54 min. Cette étude peut fournir des informations fondamentales et des informations précieuses sur les processus d’extraction industrielle de Herba Polygoni Capitati.
REMERCIEMENTS
Les auteurs remercient chaleureusement Guizhou Warmen Pharmaceutical Corporation pour la fourniture de matières premières et le soutien financier du programme spécial scientifique et technologique majeur de la province de Guizhou (n ° 2011 6019-02), du programme provincial de Guizhou de l'équipe de talents en innovation scientifique et technologique sur l'analyse pharmaceutique (n ° 2011 6019-02). . 2011 4008), Programme spécial provincial du Guizhou sur la recherche et le développement de l'industrie scientifique et technologique sur la modernisation des MTC (n° ZY 2011 3013), le Laboratoire clé caractéristique de normalisation des médecines traditionnelles chinoises et des médecines nationales et le Laboratoire clé caractéristique du Guizhou Département provincial de l'éducation. (N° KY 2012 005).
Notes de bas de page
Source de soutien : Néant
Conflit d'intérêt: Aucun déclaré.