반응 표면 방법론을 통한 Herba Polygoni Capitati의 퀘르시트린 및 총 플라보노이드 추출 최적화

추상적인

목적:

 

반응 표면 방법론(RSM)을 사용하여 Herba Polygoni Capitati(중국어로 Touhualiao)에서 퀘르시트린 및 총 플라보노이드(TF) 추출 조건을 최적화합니다.

재료 및 방법:

 

용매 조성(%), 용매-재료 비율(ml/g) 및 추출 시간(분)을 포함한 세 가지 독립 변수가 반응, 퀘르시트린 및 TF 수율에 미치는 영향을 조사하기 위해 중앙 복합 설계(CCD)를 채택했습니다.

결과:

 

최적화된 추출 조건은 다음과 같습니다: 에탄올 농도, 65.63%; 용매-물질 비율, 10.55:1(ml/g); 추출 시간, 54.33분. 확립된 수학적 모델은 실험 매개변수의 요인을 잘 설명하고 퀘르시트린과 TF의 최적 수율에 대한 통계적으로 정확한 예측을 제공했습니다.

결론:

 

실험값은 확립된 수학적 모델에 의해 예측된 값과 일치하여 사용된 모델의 적합성과 추출 조건 최적화에 있어 RSM의 성공을 나타냅니다.

키워드: 중심합성설계, 추출, Herba Polygoni Capitati, 최적화, 반응표면방법론

소개

 

Herba Polygoni Capitati, 식물의 공중 부분 또는 전체 다각형 capitatum 부흐.-햄. ex D. Don은 중국, 특히 일부 소수민족 지역에서 오랫동안 한약(TCM) 중 하나로 사용되어 왔습니다. Herba Polygoni Capitati의 활성 화학 성분은 플라보노이드, 페놀산 및 탄닌으로 확인되었습니다.,,] 플라보노이드가 주요 생리 활성 화합물로 간주되었습니다. 약리학적 및 임상 연구에 따르면 퀘르세틴과 그 글루코사이드는 항카린원성을 지닌 생리활성 화합물이었습니다.,] 항산화[,] 및 효소 조절 활성.[,,] 역학 연구에서도 플라보노이드(주로 케르세틴)의 과다 섭취와 심혈관 질환 사이의 역의 관계가 밝혀졌습니다.[]

TCM 추출물은 전 세계적으로 수세기 동안 전통적인 치료법과 약초 요법에 사용되어 왔습니다.,] 그리고 이 치료 시스템에는 귀중한 경험이 많이 축적되어 있습니다. 천식치료의 충혈완화제로 사용되는 암페타민 유사 자극제인 에페드린은 한약재에서 추출 분리되었습니다. 에페드라 허브.[]의 추출물 은행 나무특히 표준화된 EGb 761은 치매 및 인지 장애에 가장 널리 사용되는 약초 요법 중 하나였습니다.] 용매 조성, 추출 시간, 추출 온도, 용매-물질 비율과 같은 많은 요소가 추출 효능에 큰 영향을 미칠 수 있으므로 추출 매개변수는 인간 대상에서 예방적 또는 치료적 가치가 있는 더 많은 성분을 얻기 위해 최적화되어야 합니다.[]

Herba Polygoni Capitati에 제시된 모든 화합물 중에서 페놀산과 플라보노이드 성분이 가장 많은 관심을 받았으며 약리학적 효과에 중요한 것으로 간주되었습니다.] 한 번에 1인자 접근 방식만으로 Herba Polygoni Capitati에서 갈산(GA) 또는 TF를 추출합니다.[] 또는 직교 디자인과 연관됨,[]가 이전에 보고되었습니다. 한 번에 하나의 요인만 가변하는 접근법은 다른 모든 요인은 일정하게 유지하면서 한 번에 하나의 요인만 가변합니다.[] 시간이 많이 걸리고 요인 간의 상호 작용 효과를 포함하지 않기 때문에 잘못된 결론을 내릴 수 있습니다. 직교 설계는 테스트 설계에 유용합니다.] 그러나 모델 방정식으로부터 예측을 제공하지는 않습니다. 통계 및 수학적 기술의 모음인 반응 표면 방법론(RSM)은 변수 간의 가능한 상호 작용 효과를 설명하므로 이러한 단점을 극복할 수 있습니다.[,] 독립 매개변수의 함수로서 반응의 반응 표면 플롯과 등고선 플롯은 RSM으로 얻을 수 있습니다.[] 본 연구에서는 퀘르시트린과 TF의 동시 수율을 극대화하기 위해 Herba Polygoni Capitati로부터 추출 조건(용매 비율, 용매-물질 비율, 추출 시간 등)을 최적화하는 RSM 접근법을 적용하였다.

 

재료 및 방법

 

재료 및 화학물질

 

Deyuan Chen 교수가 식물학적으로 확인한 Herba Polygoni Capitati는 중국 구이저우에 있는 Guizhou Warmen Pharmaceutical Corporation에서 구입했습니다. Herba Polygoni Capitati의 전체 식물을 강제 대류가 가능한 범용 오븐(101-2AB Taijin, 중국)에서 50°C에서 4시간 동안 건조했습니다. 건조된 시료를 회전밀(DFY-200 Wenling, China)에서 분쇄하고 분말을 체질하였다. 연구를 위해 10~40 mesh(0.3~2mm, id) 크기의 입자를 수집했습니다. 참조 화합물인 퀘르시트린(111538-200403)과 루틴(080-9303)은 중국 국립생물의약품통제연구소(중국 베이징)에서 구입했습니다. 아세토니트릴과 메탄올은 HPLC 등급(Tedia, USA)이었습니다. 물은 순수한 물을 마시는 데에 강했습니다(광둥 소재 Le Bai Shi Food and Beverage Ltd.). 포름산은 MS 등급(Roe Scientific Inc, USA)이었습니다. 다른 모든 화학 물질과 용매는 분석 등급이었으며 상업적으로 이용 가능했습니다.

 

샘플 준비

 

허바폴리고니카피타티 분말 2g을 정밀히 달아 일정한 조건에서 추출한 후 3500℃에서 원심분리하였다. rpm 10분 동안. 후속 분석을 위해 상청액을 수집하고 여과지를 통해 여과했습니다.

 

기구

 

본 연구에 사용된 분석 시스템은 다음과 같습니다. UV-Vis 스펙트럼은 경로 길이가 1cm인 셀을 사용하여 이중 빔 분광 광도계(Cary 100-Varian)에서 기록되었습니다. 진공 탈기 장치, 4차 펌프, 자동 샘플러, 온도 조절 컬럼 구획 및 DAD 검출기로 구성된 DIONEX/UltiMate 3000 시리즈 UHPLC-DAD 시스템(DIONEX, ThermoFisher, Sunnyvale, USA)을 사용하여 크로마토그램을 획득했습니다.

 

총 플라보노이드 함량 측정

 

총 플라보노이드 함량(TFC)은 이전에 설명한 알루미늄 비색법에 따라 결정되었습니다.,,,] 수정했습니다. 간략하게 말하면, 각 식물추출물 0.5ml를 관련용매 4.3ml와 혼합한 후, 10% 염화알루미늄(AlCl) 0.1ml를 첨가하였다.3) 및 1M 아세트산나트륨(CH) 0.1ml3 쿠나). 루틴(Rutin)을 참조 표준으로 사용했습니다. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 반응 혼합물을 블랭크에 대해 405nm에서 측정했습니다. 각 샘플의 TFC 값을 계산하고 건조된 물질 그램당 루틴 당량의 밀리그램(DM)으로 표시했습니다.

 

크로마토그래피 분리

 

추출물의 HPLC 분석은 DIONEX/UltiMate 3000 시리즈를 사용하여 수행되었습니다. 분리는 ZORBAX SB-C에서 수행되었습니다.18 유속 1.0ml/min의 컬럼(150mm × 4.6mm, 5μm, Agilent, CA, USA). 이동상은 A(아세토니트릴)와 B(물 중 0.2% 포름산)의 조합으로 구성되었습니다. 선형 구배는 5%에서 15% A(v/v) 5분에 16% A로, 10분에 16%A로, 20분에 20%A로, 이어서 20%A로 22분 동안 유지했습니다. 각 실행 후에는 5분의 평형 시간이 소요되었습니다. UV 검출기의 파장은 260nm로 설정되었고, 컬럼 오븐의 온도는 30°C로 유지되었습니다. 주입 전에 샘플을 여과했습니다 (PTFE 주사기 필터; 0.45 μm; Hanbon Ltd, China; 013045). 데이터는 Chromeleon 7.1 소프트웨어를 사용하여 수집 및 분석되었습니다.

 

표준 용액의 준비

 

루틴과 퀘르시트린의 표준 원액은 각각 190.8μg/ml 및 106.0μg/ml의 농도로 메탄올에서 제조되었습니다. 피크 면적과 흡광도로부터 각각 도출된 선형 최소 제곱 회귀 방정식을 사용하여 퀘르시트린과 TF의 표준 곡선을 보정하고, 표준 곡선에 따라 시료 내 퀘르시트린과 TF의 농도를 계산했습니다.

 

적절한 추출 조건 선택

 

RSM을 사용하여 연구를 개발하기 전에 관련 독립 변수를 선택하고 실험 범위를 결정하기 위해 일련의 예비 테스트를 수행했습니다. 예비 실험의 첫 번째 단계는 Herba Polygoni Capitati의 추출에 적합한 방법을 선택하는 것이었습니다. 세 가지 다른 접근법, 즉 침용, 환류 및 초음파 추출 추출을 테스트했습니다. 예비 실험의 두 번째 단계는 Herba Polygoni Capitati에 적합한 추출 용매를 선택하는 것이었습니다. 0-100%(수중 에탄올 또는 메탄올) 범위의 다양한 추출 용매를 사용하여 최상의 용매를 결정했습니다. 셋째, 용매-재료 비율(6:1, 8:1, 10:1, 12:1, 14:1; v/m) 추출에 대한 조사는 에탄올:물(70:30, v/v)을 용매로 사용하여 실온에서 30분 동안 초음파 추출을 추출했습니다. 넷째, 추가 조사를 위해 적절한 입자 크기를 선택했습니다. 마지막으로 추출 시간(10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분)도 테스트했습니다.

이러한 결과를 바탕으로 중심합성설계(CCD)를 위한 각 관련변수의 3개 수준(하위, 중간, 상위)을 선정하여 반응패턴을 분석하고 모형을 구축하였다.

 

통계 분석

 

CCD 절차에서 얻은 실험 데이터는 RSM을 사용하여 다음과 같은 2차 다항식 모델(Eq. (1))과 얻은 회귀 계수에 맞게 분석되었습니다.

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어디 X1, 엑스2,…, 엑스케이 응답 Y에 영향을 미치는 인코딩된 독립 변수입니다. β0 (i = 1, 2,…, k), βii (i = 1, 2,…, k) 및 βij (i = 1, 2,…, k)는 각각 절편, 선형, 2차 및 상호 작용 항에 대한 회귀 계수입니다. k는 변수의 수입니다.

실험 데이터의 회귀 및 그래픽 분석에는 Design Expert 버전 8.0.5b(STAT-EASE Inc.) 소프트웨어가 사용되었습니다. 모델의 적합도 품질은 결정 계수를 사용하여 평가되었습니다(아르 자형2) 및 분산 분석(ANOVA). 반응 표면과 등고선 플롯은 적합 2차 다항 방정식을 사용하여 개발되었습니다.

 

결과 및 토론

 

시스템 정밀도, HPLC 또는 UV-Vis의 선형성

 

추출효율 평가를 위한 마커로 Quercitrin과 TF를 지정하였다. 참조 표준과 Herba Polygoni Capitati 추출물의 HPLC 프로파일은 다음과 같습니다. 그림 1. 퀘르시트린 수준에 대한 피크 면적의 검량선은 다음과 같습니다. 와이 = 47.622 엑스 − 0.033-1.06μg의 선형 범위에서 0.2231(아르 자형2 = 1.0000, 와이 = 피크 면적 및 엑스 = 퀘르시트린 양). TF 양에 따른 흡광도의 검량선은 다음과 같다. 와이 = 0.0029 엑스 – 74.32-267.12 μg의 선형 범위에서 0.0088(아르 자형2 = 0.9996, 와이 = 흡광도 및 엑스 = TF 금액).

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260nm에서 인증된 참조 화합물인 퀘르시트린(a)과 Herba Polygoni Capitati(b) 추출물의 HPLC 크로마토그램

 

매개변수 결정 및 수준 선택

 

추출 방법의 효과

 

침연, 환류 및 초음파 처리 추출을 포함한 세 가지 추출 방법을 다음 매개변수 값으로 테스트했습니다: 입자 크기, 10 메쉬; 용매-재료 비율, 10:1(ml/g); 추출 기간, 환류 및 초음파 추출 추출에 30분, 침연 추출에 12시간; 용매 조성물, 70% 수성 에탄올; 온도, 실내 온도. DM 1g당 추출된 퀘르시트린과 TF의 양은 다음과 같습니다. 그림 2. 실험 결과에 대한 ANOVA는 세 가지 추출 방법 간에 유의미한 차이를 보여주었습니다( < 0.01). 한편, 초음파 추출 방법은 퀘르시트린과 TF의 수율이 가장 높아 추출 방법으로 선택되었습니다.

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Herba Polygoni Capitati에서 퀘르시트린(왼쪽)과 TF(오른쪽)를 추출하는 다양한 방법의 효과

 

추출 용매의 영향

 

용매는 분석물질의 회수에 영향을 미치는 핵심 요소입니다. 본 연구에서는 물, 다양한 농도의 메탄올 및 다양한 농도의 에탄올을 테스트했습니다. 에 표시된 바와 같이 그림 3, 60% 수성 에탄올의 추출 효율이 가장 높았다. 따라서 추가 RSM 조사를 위해 용매 조성의 하위, 중간 및 상위 수준으로 50%, 60% 및 70% 에탄올을 선택했습니다.

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Herba Polygoni Capitati에서 초음파를 이용한 케르시트린 및 TF 추출에 대한 용매 조성의 영향

 

용매-재료 비율

 

추출에 대한 용매-재료 비율의 영향은 5가지 값(6:1, 8:1, 10:1, 12:1, 14:1; v/m). 적합한 용매-재료 비율 값은 규칙에 따라 선택됩니다.] 그 값은 너무 작거나(생리 활성 화합물을 완전히 추출할 수 없음) 너무 높아서는 안 됩니다(처리 비용이 감당할 수 없을 정도로 높음). 제시된 바와 같이 그림 4, 퀘르시트린과 TF 수율의 증가 추세가 관찰되었으며 비율이 약 10:1일 때 가장 높은 값에 도달했습니다. 가능한 설명은 용매-물질 비율의 증가가 용매의 세포 내 확산성을 증가시키고 세포로부터 페놀성 화합물의 탈착을 향상시킬 수 있다는 것입니다.] 본 연구에서는 비율 값이 10:1보다 높을 때 퀘르시트린과 TF 수율이 약간 감소하는 것으로 나타났는데, 이는 제품 수집이나 공정 운영 시 손실이 더 크기 때문일 수 있습니다. 따라서 후속 연구에서는 용매-재료 비율을 RSM의 중간 수준으로 10:1로 설정했습니다.

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퀘르시트린 및 TF 수율에 대한 용매-재료 비율의 영향

 

입자 크기의 영향

 

입자 크기는 고려해야 할 또 다른 중요한 변수입니다. 일반적으로 추출효율은 입자크기가 작을수록 증가한다.그림 5]. 본 연구에서는 입자 크기를 직경 0.45~0.9mm로 설정했습니다.

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퀘르시트린 및 TF의 수율에 대한 입자 크기의 영향

 

추출 시간의 영향

 

적절한 추출 시간을 선택하는 것이 예비 연구의 마지막 단계였습니다. 최적의 값을 조사하기 위해 10, 20, 30, 40, 50 및 60분의 다양한 추출 길이를 테스트했습니다. 그 결과, 추출시간이 10분에서 50분으로 길어질수록 퀘르시트린과 TF의 수율이 증가하는 것으로 나타났다.그림 6]. 50분 수준에서 퀘르시트린과 TF 수율이 가장 높은 수준에 도달했습니다. 따라서 추출 시간의 하위, 중간, 상위 수준으로 40분, 50분, 60분을 선택하였다.

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추출 시간이 퀘르시트린 및 TF 수율에 미치는 영향

 

RSM을 통한 추출 매개변수 최적화

 

다중선형회귀 결과 및 적합모델의 적합성 분석

 

20개의 실험 실행으로 구성된 3요소 및 3단계 회전 가능 CCD가 중심점에서 6번의 반복실험으로 사용되었습니다. 실험 순서를 무작위로 지정하여 설명되지 않는 변동성의 영향을 최소화했습니다. 독립 변수는 용매 조성(X1, %, v/v, 에탄올/물), 용매-재료 비율(X2, ml/g) 및 추출 시간(X3, min) 퀘르시트린과 TF 수율을 지표로 사용합니다. 고정된 입자 크기(0.45-0.9mm)가 선택되었습니다. 모든 실행의 퀘르시트린 및 TF 수율은 다음과 같습니다. 1 번 테이블. 이러한 결과를 바탕으로 2차 다항식 모델(Eq. (1))을 이용한 다중 선형 회귀를 수행하였다.

 

1 번 테이블

독립 변수(X)의 원래 형식과 코드화된 형식으로 회전 가능한 중심 합성 설계 설정1, 엑스2, 엑스3) 및 반응 변수인 퀘르시트린과 TF에 대한 실험 결과

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독립 변수의 ANOVA는 다음과 같습니다. 표 2 이는 이 세 가지 독립 변수가 모두 추출 효율에 큰 영향을 미친다는 것을 나타냅니다( < 0.05). 다중 결정의 해당 계수를 사용하여 피팅된 2차 모델의 회귀 매개변수(아르 자형2)에 표시되었습니다. 표 3. 좋은 피팅이 달성되었으며 응답의 가변성이 모델에 의해 설명되었습니다. 높은 아르 자형2 퀘르시트린과 TF에 대해 각각 0.94와 0.96의 값은 실험 데이터가 모델에 의해 예측된 데이터와의 호환성을 확인했음을 의미합니다. 변동 계수의 낮은 값(퀘르시트린의 경우 1.92%, TF의 경우 3.28%)은 적합 모델에서 얻은 결과가 신뢰할 수 있음을 나타냅니다. 조정된 결정계수(아르 자형2 Adj.) 값은 포함된 모든 *유의적인 용어와 높은 값을 사용하여 표현식을 재구성합니다. 아르 자형2 조정 (아르 자형2 조정 각각 87%, 92%와 같음)는 모델의 중요성을 뒷받침합니다.

 

표 2

반응 표면 2차 모델의 분산 분석

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표 3

반응 변수인 퀘르시트린과 TF에 대한 예측된 2차 모델의 회귀 계수

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적합성 결여 테스트는 모델 적합도의 적절성을 확인하는 데 사용되었습니다. 적합성 결여 테스트에 대한 ANOVA는 퀘르시트린 및 TF 수율과 관련하여 유의미하지 않았습니다( > 0.05), 이는 모델이 실험 데이터에 적절하게 적합할 수 있음을 나타냅니다.표 4].

 

표 4

퀘르시트린 및 TF에 대한 적합성 테스트 부족에 대한 분산 분석

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반응 표면 분석

 

부터; 모델이 좋은 피팅을 보여주고, 응답 값은 회귀 방정식으로 충분히 설명됩니다. 독립 변수의 상호 작용을 보여주고 최대 반응에 대한 각 독립 변수의 최적 값을 결정하기 위해 반응 표면 곡선을 플롯했습니다. 독립변수와 종속변수 사이의 관계는 3차원(3D) 반응 표면 플롯과 2차원(2D) 등고선 플롯으로 설명되었습니다. 회귀식을 그래픽으로 표현한 3차원 반응표면과 2차원 등고선도를 제공하였다. [그림77 그리고 그리고8].8]. 각 등고선 곡선은 다른 독립 변수를 고정점에 유지하면서 두 독립 변수의 무한한 조합 수를 나타냅니다. 이러한 방식으로 3D 응답 표면을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 그림 7a 은 용매 조성과 용매-물질 비율에 대한 모델을 통해 개발된 3차원 반응 표면 함수를 보여줍니다. 용매 조성은 반응에 대한 2차 효과를 보여주었습니다. 퀘르시트린의 함량은 65% 에탄올을 사용할 때 가장 높은 값에 도달합니다. 마찬가지로, 용매-재료 비율은 동시에 퀘르시트린에 대한 2차 효과를 보여주었습니다. TF에 대한 용매 조성 및 용매-재료 비율의 영향 결과는 다음과 같습니다. 그림 8a. 용매 조성은 60%와 70% 에탄올 사이에서 최대값을 산출하는 반응에 대해 2차 효과를 나타냈습니다. 마찬가지로, 용매-물질 비율이 증가함에 따라 용매 조성이 고정되면 TF는 점차 증가하여 용매-물질 비율이 약 10:1일 때 가장 높은 값에 도달했습니다.

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용매 조성(X1), 용매 물질 비율(X2) 및 추출 시간(X3)이 퀘르시트린 수율에 미치는 영향을 보여주는 반응 표면 플롯(a, c 및 e) 및 등고선 플롯(b, d 및 f)

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TF 수율에 대한 용매 조성(X1), 용매 재료 비율(X2) 및 추출 시간(X3)의 영향을 보여주는 반응 표면 플롯(a, c 및 e) 및 등고선 플롯(b, d 및 f)

퀘르시트린 및 TF 수율의 반응 값에 대한 독립변수 용매 조성 및 추출 시간의 효과가 그림에 표시되어 있습니다. 그림7c,7c,7일,7일,8c,8c,8d,8일, 각각. 두 독립변수 사이의 상호작용 관계는 다른 독립변수인 용매-물질 비율을 정지점에서 일정하게 유지하여 생성된 등고선 플롯을 살펴보면 쉽게 이해할 수 있다. [그림7d7일 그리고 그리고 8d].8일]. 용매 조성 및 추출 시간이 증가할수록 퀘르시트린과 TF의 수율은 유의하게 증가하였다. 그러나 독립 변수가 특정 값을 초과하면 퀘르시트린과 TF 수율이 더 이상 증가하지 않습니다. 용매 조성과 추출 시간의 상호작용은 퀘르시트린 수율에 영향을 미치는 데 통계적으로 유의하지 않았지만, < 0.01) TF 추출에 미치는 영향.

피규어 그림7e7e 그리고 그리고8e8e 퀘르시트린과 TF의 수율에 대한 용매-재료 비율과 추출 시간의 영향을 입증했습니다. 추출 시간과 용매-물질 비율이 증가함에 따라 퀘르시트린과 TF의 수율이 증가하는 것으로 나타났는데, 이는 퀘르시트린과 TF의 추출 수율이 추출 시간과 용매-물질의 비율에 비례함을 의미한다. Herba Polygoni Capitati로부터 퀘르시트린과 TF 추출에 대한 두 독립변수의 상호작용은 통계적으로 유의하지 않았습니다.

 

검증 실험

 

모형의 예측력을 검증하기 위해 RSM의 능선 분석을 통해 도출된 최적화 조건에서 최적 반응변수를 검정하였다. 그 결과, 관측값은 모델 예측값의 95% 신뢰구간 내에서 만족스럽게 달성될 수 있었다[표 5].

 

표 5

반응변수인 퀘르시트린과 TF에 대한 예측값과 관측값의 비교

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결론

 

CCD와 결합된 한 번에 한 가지 요소 접근 방식을 사용하여 용매 조성, 용매-재료 비율 및 추출 시간을 포함한 초음파 보조 추출 매개변수가 Herba Polygoni Capitati에서 퀘르시트린 및 TF를 추출하기 위해 최적화되었습니다. 결과는 2차 다항식 모델이 추출 데이터에 대해 만족스러운 설명을 제공한다는 것을 보여주었습니다. 최적화된 조건은 다음과 같습니다: 추출 방법, 초음파 추출; 용매인 경우 65% 수성 에탄올로 마무리하는 것이 좋습니다. 입자 크기, 0.45-0.9mm; 용매-재료 비율은 10:1로 반올림됩니다. 추출 시간은 54분으로 반올림됩니다. 이 연구는 Herba Polygoni Capitati의 산업 추출 프로세스에 대한 기본 정보와 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

 

감사의 말

 

저자들은 구이저우성 주요 과학 기술 특별 프로그램(2011-6019-02), 구이저우성 의약품 분석 과학 기술 혁신 인재 팀 프로그램(No. 2011 6019-02)의 원료 및 재정 지원을 제공한 Guizhou Warmen Pharmaceutical Corporation에 감사드립니다. . 2011 4008), 한의학 현대화에 관한 과학 기술 산업 연구 및 개발에 관한 구이저우성 특별 프로그램(No. ZY 2011 3013), 한의학 및 민족 의학 표준화의 특성 핵심 연구소 및 구이저우 특성 핵심 연구소 지방 교육부. (번호 KY 2012 005).

 

각주

지원 출처: 무

이해 상충: 선언된 바가 없습니다.

 

참고자료

 

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