Efecto protector de Tisochrysis lutea sobre el síndrome del ojo seco mediante la inhibición de NF-κB

Materiales

Materiales in vivo/in vitro

T. lutea se obtuvo de Microalgae Ask Us Corp. (Gangneung, Corea). La escopolamina, la fluoresceína y la hematoxilina y eosina (H&E) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) para experimentos con animales. El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): F12, la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), el suero bovino fetal (FBS) y la solución de tripsina-EDTA 0,251 TP3T se obtuvieron de Life Technologies (Carlsbad, CA, EE. UU.). La solución antibiótica, que comprende 10.000 U/ml de penicilina y 10.000 μg/ml de estreptomicina, se adquirió de Hyclone Laboratories Inc. (South Logan, UT, EE. UU.). El TNF-α humano recombinante se obtuvo de sistemas de I+D (Minneapolis, MN, EE. UU.). Los anticuerpos primarios que incluyen la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), la quinasa N-terminal anti-c-jun (JNK), anti-p38, anti-α-tubulina y anti-β-actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, California, EE.UU.). Otros anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) se obtuvieron de Cell Signaling Technology, Inc (Beverly, MA, EE. UU.). Los productos químicos, incluido el bromuro de 3–4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).

Materiales de análisis químico.

Los PUFA se identificaron utilizando una solución que contenía 37 sustancias estándar de PUFA, adquirida en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El ácido valérico se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) para usarlo como estándar interno. Disolventes, incluida la solución de trifluoruro de boro y metanol, norte-hexano, Na₂ENTONCES₄, CH₃Cl, MeOH y NaCl, utilizados para extraer PUFA de T. lutea se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).

Declaración ética

Esta investigación fue aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto Coreano de Ciencia y Tecnología (KIST): KIST No. 2020-002, Instituto Gangneung, y siguió la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología sobre la Uso de animales en investigaciones oftálmicas y de la visión. Además, seguimos las recomendaciones de Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con las regulaciones y directrices aplicables.

Experimentos con animales e inducción del modelo DES.

Los ratones se alojaron en una habitación para animales con aire acondicionado y se mantuvieron a 22 °C ± 2 °C, 50% ± 10% de humedad y un ciclo circadiano de 12 h de luz/12 h de oscuridad. Se proporcionó agua y comida ad libitum. Los ratones se aclimataron durante una semana antes de dividirlos aleatoriamente en cinco grupos de siete ratones BALB/c machos de 6 semanas de edad (Orientbio, Gyunggi-do, Corea). El DES se indujo experimentalmente en ratones dos veces al día mediante inyección intraperitoneal de 200 μl (2,5 mg/ml) de escopolamina diluida en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). T. lutea se administró por vía oral a grupos de ratones diariamente en concentraciones de 0 (control del vehículo), 100, 150 o 300 mg/kg en 200 μL de agua destilada. El grupo de control recibió PBS sin escopolamina. Cuando T. lutea se administró por vía oral, en el grupo control y DES se utilizaron 200 μL de agua destilada. La producción de lágrimas se cuantificó después de dos semanas utilizando una tira reactiva de Schirmer estándar colocada en el tercio inferior del párpado temporal antes de cerrar el ojo durante 1 minuto. Luego se retiró la tira y se midió la longitud del punto húmedo en milímetros para determinar el valor de la prueba de Schirmer. Se utilizó tinción de la superficie corneal para determinar el alcance de los cambios en la superficie corneal. Se observó y calificó la superficie corneal después de inyectar una gota de fluoresceína 3% en la conjuntiva lateral inferior. La tinción corneal se evaluó a ciegas. Los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical. Las córneas se extrajeron moviendo el párpado del ratón y usando unas pinzas para cortar el nervio óptico del globo ocular y extraer la córnea. El cristalino se extrajo del interior de la córnea y se almacenó a -80 °C. Se extrajo la glándula lagrimal de la mandíbula inferior del ratón con unas pinzas y se cortó la epidermis del área extraída para revelar la mitad inferior de la cara. La glándula lagrimal cerca de la mandíbula inferior se aseguró y se extrajo y luego se almacenó a -80 °C protegida de la luz.

Histología

Los tejidos de la epidermis corneal y de las glándulas lagrimales se recogieron y fijaron en formaldehído 10%, seguido de procesamiento para inclusión en parafina y corte. Las secciones se tiñeron con H&E y se examinaron con un aumento de 40 × utilizando un microscopio (TE-2000U, Nikon, Tokio, Japón). El espesor del epitelio corneal central se determinó dividiendo cada córnea en cinco secciones.

Tinción DAB para análisis inmunohistoquímico (IHC)

Se tomaron tejidos de las glándulas lagrimales de ratones BALB/c y se fijaron con formaldehído 10%. Los tejidos de las glándulas lagrimales fijadas se incluyeron en parafina, se seccionaron (5 μm) y la parafina se eliminó tres veces durante 3 minutos usando xileno (Junsei, Tokio, Japón). Las secciones se hidrataron durante 1 min en etanol 100, 95, 70 y 50%. El antígeno de la glándula lagrimal se extrajo por microondas con tampón TRIS-EDTA (pH 9,0). Después de aplicar peróxido de hidrógeno 3% a portaobjetos de tejido durante 15 minutos, las secciones se bloquearon con 2% BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se trataron durante la noche a 4 °C con CD45 (Bio-RAD, MCA 1258GT, dilución 1:100). Después de lavar con PBS, las células se trataron durante 2 h a temperatura ambiente con IgG-HRP anti-conejo (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU., SC-2357, dilución 1:100) y se tiñeron durante 1 min con 3, Tetraclorhidrato de 3′-diaminobencidina (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Los portaobjetos se tiñeron durante 30 s con hematoxilina y se enjuagaron con agua del grifo. Luego se cubrieron las rodajas y se montaron con medio de montaje Permount™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Todos los portaobjetos fueron examinados y fotografiados utilizando un microscopio óptico (Olympus, CX43, Olympus Optical Co., Tokio, Japón). Software ImageJ (versión 1.53, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.)⁴⁸ se utilizó para realizar análisis de datos cuantitativos.

Cultivo celular ARPE-19

Se cultivaron células ARPE-19 epiteliales de la retina humana (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) en medio DMEM/F-12 (Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.) suplementado con 10% FBS (HyClone Laboratories, Logan, UT). , EE. UU.) y penicilina/estreptomicina 1% (HyClone Laboratories). Las células se sembraron a una densidad de 2 × 10⁵ por pocillo en placas de 6 pocillos y se cultivan para inducir una respuesta inflamatoria y endoplásmica.

Viabilidad celular

El efecto de T. lutea La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT como se describe en el estudio anterior.⁴⁹ pero con ligeras modificaciones. Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 1,5 x 10⁴ células/pozo y se incubaron durante 24 h. Luego las células fueron tratadas con varias concentraciones de T. lutea y se incuba durante 24 h más. El sobrenadante de cada pocillo se reemplazó con un medio de crecimiento nuevo que contenía 0,5 mg/ml de MTT y se incubó durante 1 h. Se eliminó el sobrenadante y los depósitos de formazán generados se disolvieron en 200 μL de dimetilsulfóxido. La absorbancia se midió a 570 nm. La viabilidad celular se calculó relativamente como porcentaje en comparación con los grupos de control negativo.

Análisis de Western Blot

Se realizó una transferencia Western para determinar las vías de señalización celular subyacentes al efecto antiinflamatorio de T. lutea como se describe en el estudio anterior⁴⁹, pero con pequeñas modificaciones. Las células ARPE-19 confluentes se privaron de DMEM:F12 que contenía 1% FBS y antibióticos 1% durante 24 h. Luego las células fueron tratadas con T. lutea (50 y 100 μg/mL) durante 2 h y luego se estimularon con 20 ng/mL de TNF-α durante 15 min. Las células se enjuagaron tres veces con DPBS helado y luego se lisaron en un tampón de extracción de proteínas (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do, Corea) complementado con un cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa. Los sobrenadantes de los lisados se obtuvieron por centrifugación (14.000 ×gramo, 30 min, 4 °C) y su concentración de proteínas se estimó utilizando un kit de ensayo de proteínas DCTM (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Se separaron cantidades iguales (15 a 25 μg) de proteínas celulares mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se incubaron con albúmina sérica bovina 5% o leche desnatada y luego se incubaron con una dilución 1:2000 de anticuerpos primarios (anti-phopho-ERK, anti-ERK, anti-fosfo-JNK, anti-JNK, anti-fosfo-p38 , acción anti-p38, anti-fosfo-AKT, anti-AKT, anti-fosfo-IκB-α, anti-IκB-α, anti-fosfo-p65, anti-p65, anti-α-tubulina y anti-β ) a 4 °C y 12 h. Luego, las membranas se enjuagaron con TBS-T y se trataron durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con HRP a una dilución de 1:10.000. Las bandas de proteínas se detectaron utilizando el sustrato de máxima sensibilidad SuperSignal West Femto (Thermo Fisher Scientific) y se visualizaron en un sistema de documentación de gel iBright CL1000 (Thermo Fisher Scientific). La densidad de cada transferencia de proteína se determinó utilizando el software Image J (versión 1.53, NIH)⁴⁸.

Extracción total de PUFA de T. lutea

Los PUFA totales se extrajeron de T. lutea utilizando la técnica de Folch⁵⁰. Brevemente, se colocaron 100 mg de la muestra en un vial que contenía 5 ml de CH₃Solución de Cl:MeOH (2:1, v/v) y se ultrasonicó durante 15 min. La suspensión se clarificó mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 5 min. N / A₂ENTONCES₄ Se añadió al sobrenadante que luego se filtró para eliminar el agua restante. Este paso se repitió dos veces más. Luego, la solución se concentró bajo nitrógeno gaseoso para obtener lípidos de algas puros.

Metilación de ácidos grasos

Se llevó a cabo la metilación de ácidos grasos para preparar muestras de lípidos para el análisis por cromatografía de gases (GC). El material extraído se añadió a un vial de 10 ml seguido de 1 ml de una mezcla de NaOH:MeOH 0,5 N. Esta solución contiene 400 μg/ml de cadena interna (ácido valérico). La mezcla se agitó durante 30 s y luego se incubó durante 20 min a 80 °C. Luego se enfrió la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min y luego se agregaron 2 ml de trifluoruro de boro:MeOH y luego se agitó durante 30 s. La mezcla se incubó durante 20 min a 80 °C y luego se enfrió durante 10 min. Se añadió un volumen de 2 ml de NaCl sobresaturado para inducir la separación de fases y la recogida de ácidos grasos. A continuación, 1,5 ml de norteSe añadió -hexano y la mezcla se agitó durante 30 s antes de enfriar a temperatura ambiente durante 20 min. Las capas se separaron y el sobrenadante líquido se eliminó de la mezcla y el agua se eliminó completamente usando Na saturado.₂ENTONCES₄ filtrar.

Identificación de ácidos grasos.

Los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) se examinaron utilizando un GC equipado con un detector de ionización de llama (FID; Agilent 7890A, Agilent Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.). Se inyectaron muestras (1 µl) en la columna HP-88 del GC (J&W 112-88A7, Agilent Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.) (100 m × 250 µm ID, película de 0,2 µm). El análisis por GC se realizó de la siguiente manera: las muestras se mantuvieron inicialmente a 140 °C durante 5 minutos, y luego la temperatura se aumentó a 4 °C/min hasta 240 °C durante 15 minutos. El caudal de la columna se fijó en 1 ml/min. Se empleó gas nitrógeno como gas portador para el análisis, el FID se ajustó a 280 °C y la relación de división fue 30:1. Los FAME se identificaron comparándolos con estándares conocidos. Cada muestra se midió mediante análisis de GC por triplicado.

análisis estadístico

Todos los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA unidireccional con análisis post hoc de Tukey mediante SPSS versión 18.0 (IBM Co., Armonk, NY, EE. UU.). Se realizaron al menos tres réplicas independientes para cada experimento.