브레비스카핀은 세로토닌을 조절하여 독소루비신으로 인한 심장 독성을 완화함으로써 심근 포도당과 지질 대사를 재구성합니다.

시약

다음 시약이 사용되었습니다: DMEM, FBS, 페니실린/스트렙토마이신(Meilunbio, Dalian, China), cTnI Elisa 키트(Sangon Biotech, Shanghai, China), TNF-α, IL-1β 및 IL-6 Elisa 키트(MyBioSource, 미국 샌디에이고), MDA 키트, SOD 키트, NADH 키트(Solarbio, 중국 베이징), CCK-8 키트(Beyotime Biotechnology, 중국 상하이), ROS 형광 측정 키트, JC-1 형광염료, 단백질 추출 키트 및 BCA 키트(Meilunbio, 중국 다롄). IL-1(1:100), PINK1(1:1,000), 파킨(1:1,000), AMPK(1:1,000), Akt(1:1,000), P13K(1:1,000), Tom20(1:1,000) , β-tubulin(1:1,000), mTOR(1:1,000) 및 HRP 결합 GAPDH(1:1,000) 항체는 Abclonal Biotechnology(Wuhan, China)에서 구입했습니다. RIPA 용해 완충액과 로딩 완충액은 Meilunbio(중국 다롄)에서 구입했습니다. PVDF 멤브레인은 Merck(미국 뉴저지 소재)에서 구입했습니다. DMSO는 Macklin(중국 상하이)에서 구입했고, doxorubicin, breviscapine, dexrazoxane은 Widely(중국 우한)에서 구입했습니다. Mdivi-1 억제제는 Selleck Chemicals(Houston, United States)에서 구입했습니다.

세포 배양 조건 및 세포주

세포배양을 위한 배양배지와 보충제는 Gibco-Invitrogen(Carlsbad, CA, United States)에서 구입하였고, 플라스틱 제품은 Corning(Corning, NY, United States)에서 구입하였습니다. H9c2 배아 쥐 심장 유래 심근 아세포(ATCC, CRL-1446)를 10% 소 태아 혈청, 100 단위/ml 페니실린 G 나트륨 및 100 μg/ml 황산 스트렙토마이신(37°C, 5% CO)이 포함된 DMEM에서 배양했습니다.₂). MCF-7 인간 전이성 유방암 세포(iCell, iCell-h129)를 10% 소 태아 혈청, 100 단위/ml 페니실린 G 나트륨 및 100 μg/ml 황산 스트렙토마이신이 보충된 1,640개 배지에서 배양했습니다. 4T1 마우스 유방암 세포(ATCC, FS-0158)를 10% 소 태아 혈청, 100 단위/ml 페니실린 G 나트륨 및 100 μg/ml 황산 스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양했습니다.

세포가 80-90% 합류점에 도달하면 정기적으로 계대배양하고 96웰 플레이트(1 x 10⁴ 세포/웰). H9c2 세포를 대조군인 5 μM Dox(구오 외., 2013), 5μM Dox+20μM Dexra(상웨니 외, 2020) 또는 5μM Dox+200μM 브레비스카핀(리 외, 2022) 각각 24시간 동안. DMEM만 처리한 세포를 공백 대조군으로 사용하였고, 양성 대조군으로 Dexra를 사용하였다. 마지막으로 우리는 미토콘드리아 분열 억제제인 Mdivi-1(5μM, DMSO)도 주입했습니다.Nhu 외, 2021).

산화 스트레스 평가

세포내 ROS 수준은 제조업체의 지침에 따라 형광 염료 DCFH-DA를 사용하여 측정되었습니다. 간략하게 말하면, DCFH-DA 용액(1 μM)을 PBS에서 제조하고 6-웰 플레이트에서 배양된 H9c2 세포에 첨가한 후 37°C에서 30분 동안 배양했습니다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하였다. 형광 현미경 사진은 Leica Microsystems, Ltd.의 형광 현미경을 사용하여 20× 배율로 촬영했습니다. ROS 수준은 Beckman 유세포 분석기(Beckman, California, United States)를 사용하여 정량화했습니다.

효소 지수의 결정

SOD 및 NADH의 활성은 제조업체의 지침에 따라 활성 분석 키트를 사용하여 측정되었습니다. 흡광도와 발광성은 마이크로플레이트 리더(Perkin Elmer, Massachusetts, United States)를 사용하여 측정되었습니다.

전자현미경

세포를 0.5% 글루타르알데히드 고정제로 4°C에서 15~30분간 고정하고 10,000~13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 수집했습니다. 세포를 3% 글루타르알데히드로 4°C에서 밤새 추가로 고정한 다음 실온에서 2시간 동안 1% 사산화오스뮴으로 처리했습니다. 그 후, 샘플을 아세톤 구배에서 탈수시키고, Epon 812에 매립하고, 광학적 포지셔닝을 실시하고, 초박형 단면으로 절단하였다. 절편은 우라닐 아세테이트와 납 구연산염으로 이중 염색되었습니다. 미토콘드리아 미세구조는 H-7650 투과전자현미경(Hitachi, Toyko, Japan)을 사용하여 조사되었습니다.

미토콘드리아 호흡의 결정

약 10⁶ 세포를 사용하여 O2K 호흡계(Oroboros Instruments, Austria)를 사용하여 미토콘드리아 호흡을 측정했습니다. Oroboros DatLab 7.4 소프트웨어를 사용하여 산소 농도를 결정하고 분석했습니다. 간단히 말해서, 누출 호흡 상태는 세포에서만 기록되었고, 전자 전달은 5mM ADP의 첨가에 의한 인산화와 결합되었으며, 복합체 I에 의해 지원되는 상태 3 호흡이 기록되었습니다. 복합체 I과 복합체 II의 병렬 전자 입력을 통한 최대 상태 3 호흡은 10mM 석신산염의 첨가를 통해 기록되었으며, 복합체 II 지원 호흡은 6.25μM 로테논의 존재 하에서 측정되었습니다. 최대 전자 전달 용량은 5 μM 카르보닐 시안화물 p-(트리플루오로-메톡시) 페닐-히드라존(FCCP) 존재 하에서 기록되었습니다. 마지막으로 복합체 Ⅲ를 완성하여 모든 전자전달을 차단하는 항마이신(Ama)을 투여하고 산소소모율을 비미토콘드리아산소소모량으로 측정하였다.

미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)의 변화 결정

5.5',6.6'-테트라클로로-1.1',3.3'-테트라에틸벤즈이미다졸릴카르보시아닌 요오다이드(JC-1) 염색을 사용하여 H9c2 세포의 미토콘드리아 막 전위를 평가했습니다. 간단히 말하면, 미리 결정된 실험 조건에 따라 H9c2 세포를 따뜻한 Dulbecco 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세척한 후 100 μL의 2 μM JC-1 용액(페놀 레드가 없는 DMEM에 혼합)으로 염색하고 표준 세포 배양 하에서 배양했습니다. 어둠 속에서 30분 동안의 조건. 인큐베이션 후, 세포를 따뜻한 DPBS로 세척하고, Leica Microsystems CMS GmbH 역형광 현미경(Leica Camera AG, Barnack, German)을 사용하여 20× 배율로 형광 현미경사진을 찍었습니다.

면역형광

미토콘드리아 위치를 평가하기 위해 커버슬립에서 성장한 세포를 차가운 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정했습니다. 그런 다음 세포를 0.5% Triton X-100으로 20분간 투과화시키고 5% 염소 혈청으로 30분간 차단했습니다. 세포를 4℃에서 밤새 1차 항체와 함께 배양하고 1시간 동안 2차 항체와 함께 배양하였다. 세 번 세척한 후 세포를 4'-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 염색하고 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 이미지화했습니다.

ATP 측정

또한, 세포내 ATP 농도는 제조사의 프로토콜에 따라 ATP 분석 키트를 이용하여 측정하였다. 반복적인 피펫팅을 통해 세포를 용해 완충액에서 용해시키고 4°C, 13,000g에서 10분간 원심분리했습니다. 상등액은 ATP 수준 분석에 사용되었으며 단백질 농도는 BCA 분석으로 결정되었습니다. 50 마이크로리터의 상청액을 100 μl의 ATP 검출 용액에 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양한 후 즉시 혼합하고 루미노미터(Flex Station 3)를 사용하여 발광성을 측정했습니다. ATP의 농도는 표준 곡선에 따라 계산되었으며 nmol/μg 단백질로 변환되었습니다.

웨스턴 블로팅

단백질 발현은 웨스턴 블랏으로 평가하고 농도계로 정량화했습니다. 10cm 세포 배양 접시의 Dox 및 Dox + Brev 처리 H9c2 세포를 RIPA 용해 완충액으로 용해했습니다. 5mg의 조직을 채취하고 10ml의 용해 완충액을 추가합니다. 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 BSA를 표준으로 사용하여 단백질 농도를 측정했습니다. 동일한 양의 단백질을 로딩 완충액(5X)과 혼합하고 95°C에서 5분간 끓였습니다. 그런 다음 단백질을 10%-12% SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE)에서 전기 영동하여 분리하고 PVDF 막으로 옮겼습니다. 실온에서 2시간 동안 TBST에 용해된 5% 우유로 차단한 후, 막을 토끼 다클론 GAPDH와 같은 특정 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양했습니다. 단백질 발현 및 인산화에 대한 WB 분석은 AMPK, Parkin, PINK1, Akt, PI3K, Tom20에 대한 항체를 사용하여 수행되었으며 GAPDH는 내부 대조군으로 사용되었습니다. Bio-Rad gel doc 시스템(Bio-Rad Laboratories, California, United States)을 사용하여 특정 신호를 시각화했습니다. 데이터는 평균 ± SD(N = 3) ImageJ 분석으로 정량화되었습니다.

축산

8주령 암컷 C57BL/6 마우스(SiPeiFu, Beijing, China)를 실험에 사용했습니다. 동물을 우리에 넣고 50% 습도 및 25°C ± 2°C에서 12시간 명/12시간 암주기로 사육했습니다. 동물에게 표준 펠릿 사료와 물을 자유롭게 제공했습니다. 혈장은 200g에서 10분 동안 4°C에서 원심분리하여 얻었고 추출 전에 -80°C에서 보관했습니다.

조사는 다음 사항에 부합합니다. 실험실 동물의 관리 및 사용 지침 미국 국립보건원(NIH Publication No. 85-23, 1985년 개정)에서 출판되었습니다.

동물 실험 프로토콜

마우스를 대조군, 모델 그룹(Dox 그룹), 3개 용량의 Dox + Brev 그룹 및 Dox + Dexra 그룹을 포함하여 6개의 치료 그룹에 무작위로 할당했습니다.

인간 치료 요법을 모방하기 위해 누적 용량 12mg/kg의 Dox를 투여했습니다. ~을 통해 대조군을 제외하고 매주 3회 복강내 주사(0일, 7일, 14일에 4mg/kg).

Brev의 효과를 조사하려면 생체 내에서, 마우스에 Brev를 투여한 후 매일 Brev 4.8을 복강내 주사하고 Brev를 16 mg/kg을 3주 동안 투여하였으며, Dox + Dexra 치료군 마우스에는 Dox 외에 12 mg/kg Dexra를 3주 동안 복강내 주사로 투여하였다. 치료. (알렉상드르 외, 2020). Brev와 Dexra는 Dox 주사 후 치료를 받았습니다. Dox를 처음 주사한 후 3주 후에 생존 여부를 매일 모니터링하고 심장초음파 검사를 통해 심장 기능을 평가했습니다.리 외, 2018).

대조군에는 같은 양의 생리식염수를 주사하였다. Dox 투여 1주일 후 마우스를 희생시켰다.

종양 연구

마우스에게 1×10⁵ 4T1 유방 종양 세포. 세포 주입 1주일 후 종양의 평균 직경이 2mm보다 클 때 이전에 설명한 대로 마우스를 Dox 또는 브레비스카핀으로 치료했습니다. 종양 크기는 최대 4주 동안 일주일에 2번 측정되었으며, 종양 부피는 다음 방정식으로 계산되었습니다: V = 4π/3×(L/2)2× (W/2), 여기서 V, L 및 W는 종양의 부피, 길이 및 너비.

¹⁸F-플루오로데옥시글루코스 PET/CT 영상

Dox 및 브레비스카핀 그룹 마우스(밤새 금식)를 2% 이소플루란으로 마취하고 ~11MBq/0.2ml의 플루오로데옥시글루코스(FDG) PET를 주사했습니다. ~을 통해 꼬리 정맥을 제거한 후 우리로 돌아갔습니다. 40분 후, 마우스를 2% 이소플루란으로 다시 마취시키고 microPET Focus 220(Siemens Company, Berlin, Germany)의 정위 침대에 배치했습니다. 그런 다음 20분 정적 PET 스캔이 시작되었습니다. 그 후, PET 영상과의 해부학적 공동 등록을 위해 180mAs의 X선 빔 강도와 80kVp의 X선관 전압으로 microCAT II(독일 베를린 소재 Siemens Company)에서 마우스를 영상화했습니다.

환자

4시간 이상의 금식 후 혈당 수치를 120mg/dl 미만으로 유지한 후 모든 환자에게 이 약을 정맥 투여했습니다. ¹⁸F-FDG(5.5MBq/kg). PET/CT 스캔은 결합된 PET/CT 전기(Siemens Company, Berlin, Germany)를 사용하여 주사 후 60분에 시작되었습니다. 모든 스캔은 3차원 모델에서 수행되었습니다. 감쇠 교정 및 해부학적 상관관계를 확인하기 위해 먼저 저선량 CT 스캔을 획득했습니다. 윤리적 허가는 칭다오대학교 부속병원에서 발행한 윤리위원회 승인 문서 지침(QDU-HEC-2022057)을 준수합니다.

심장 기능 및 조직 병리학 분석

각 그룹의 마우스 심장 조직을 4% 파라포름알데히드에 보관하고 파라핀 왁스에 묻혀서 4mm 섹션으로 연속적으로 절단했습니다. 조직 섹션은 파라핀 제거되었습니다 ~을 통해 자일렌에 담그고(각각 5분 동안 3회) 하강하는 일련의 알코올(100%, 90%, 85% 및 75% 알코올, 각 5분)을 사용하여 재수화합니다. 조직학적 분석을 위해 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색했습니다. 심장의 형태학적 및 섬유성 변화를 조사하기 위해 생검 샘플을 Masson의 삼색 염색을 사용하여 염색했습니다. 파란색 염색은 콜라겐 축적을 나타냅니다. 면역조직화학은 제조업체의 지침에 따라 Histone Simple 염색 키트(Nichirei, Tokyo, Japan)를 사용하여 수행되었습니다. 절편을 메탄올 중 3% H2O2로 15분 동안 처리하여 내인성 퍼옥시다제를 불활성화시킨 다음 실온에서 1차 항체 IL-1, 1:100과 함께 1시간 동안 배양했습니다. 이어서, Leica Microsystems' CMS GmbH 역형광 현미경(Leica Camera AG, Barnack, Germany)을 사용하여 초미세구조를 20× 배율로 관찰했습니다.

포도당 수준 측정

생쥐는 정상적인 음식을 먹도록 유지되었습니다. 실험 당일 쥐를 6시간 동안(오전 8시부터) 금식시킨 후 혈액을 채취하였다. ~을 통해 포도당 수치 측정을 위한 꼬리 정맥.

H9c2 래트 심근아세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고 원심분리하고 초음파로 분쇄한 후 표준 세포 배양 조건에서 10분간 배양했습니다. 인큐베이션 후, 마이크로플레이트 판독기(Perkin Elmer, Massachusetts, United States)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

효소 면역 분석법

마우스 조직을 용해 완충액으로 용해시켰다. 샘플을 20초 동안 30Hz 펄스를 사용하여 Qsonica 균질화기로 초음파 처리한 후 10분 동안 12,000g에서 원심분리했습니다. 상청액을 수집하고 200μl 바이알에 분취한 후 -80°C에서 보관했습니다. 샘플의 단백질 농도는 BCA 분석으로 정량화되었습니다. 샘플은 제조업체의 프로토콜에 따라 TNF-α, IL-1β 및 IL-6에 대한 효소 결합 면역흡착 분석 키트를 사용하여 분석되었습니다. 광학 밀도는 VICTOR Nivo™ 마이크로플레이트 판독기(Perkin Elmer, Massachusetts, United States)를 사용하여 450 nm에서 측정되었습니다.

마우스 대사체의 변화 결정

혈액 샘플을 재현탁시키고, 얼음 위에서 배양하고, 원심분리하고, 최종 농도로 희석하고, 원심분리했습니다. 마지막으로 분석을 위해 상청액을 LC-MS/MS 시스템에 주입했습니다. UHPLC-MS/MS 분석은 Orbitrap Q Exactive와 결합된 Vanquish UHPLC 시스템(Thermo Fisher, Massachusetts, United States)을 사용하여 수행되었습니다.^TM HF 질량 분석기(미국 매사추세츠주 Thermo Fisher). 식별된 대사산물은 KEGG 데이터베이스, HMDB 데이터베이스 및 LIPID Maps 데이터베이스를 사용하여 주석을 달았습니다. 주성분 분석(PCA)과 부분 최소 제곱 판별 분석(PLS-DA)은 MetaX를 사용하여 수행되었습니다. 우리는 단변량 분석(티-테스트)를 통해 통계적 유의성을 계산합니다(피-값). VIP가 있는 대사물질>1, 피 값이 0.05 미만이고 배수 변화가 2 이상 또는 0.5 이하이면 차별적으로 풍부한 대사 산물로 간주됩니다.

안트라사이클린은 심근 산소 소비를 증가시키고 ATP 생산 속도를 감소시킵니다.

흥미롭게도 이러한 대사 보상은 심근 ROS 수준을 증가시켜 더 높은 산화 스트레스를 유발했습니다.그림 2A). O2K 에너지 대사 분석에 따르면 Dox는 심근 산소 소비를 증가시켰습니다.그림 2B) 미토콘드리아 막의 과분극을 초래했습니다(그림 2C) (이것은 또한 미토콘드리아 산화 스트레스의 증가된 수준의 징후이며 심장 허혈-재관류 모델에서 종종 볼 수 있습니다). JC-1 염색은 또한 Dox 노출이 몇몇 살아남은 세포에서 막 전위의 증가(빨간색 형광 강도의 증가)를 유발한다는 것을 보여주었습니다.그림 2D). 산소 소비 증가와 지질 산화와 같은 보상 과정이 심장에서 발생했지만, 불행하게도 포도당 대사 감소에 반응하여 심근의 ATP 생산 속도가 급격히 감소했습니다.그림 2E). 산소 소비율과 ATP 생산율을 비교한 결과, Dox 노출로 인해 심근에서 많은 양의 산소가 소비되었으나 소량의 ATP만 생산되는 것으로 나타났습니다(그림 2F), 심장의 부담이 크게 증가합니다. 이러한 에너지 출력 부족으로 인해 Dox 그룹의 에너지 수용체 AMPK 수준이 크게 증가했습니다.그림 2G). 따라서 우리는 안트라사이클린에 의한 포도당 대사 장애에 반응하여 심장이 높은 산소 소비율과 낮은 ATP 생산 속도를 나타내며 이러한 현상이 심근의 에너지 요구 사항을 완전히 충족시키지 못하고 과도한 산화 스트레스를 초래한다고 가정합니다. 따라서 에너지 격차에 대한 반응으로 심장의 지질 산화가 증가하고 더 많은 ROS가 축적되며, 이 불량한 피드백 경로가 DIC의 중요한 동인일 수 있다고 추측됩니다.

새로운 심장 보호제 브레비스카핀은 심장 포도당 대사를 촉진하고 Dox 유발 심근병증을 억제합니다.

본 연구에서는 이러한 결과를 바탕으로 심혈관 질환 치료에 사용되는 플라보노이드 브레비스카핀(breviscapine)의 DIC 진행에 대한 보호 효과를 대사적 관점에서 조사하였다. 실험 프로토콜은 다음과 같습니다. 그림 3A, 그리고 ¹⁸F-FDG PET/CT 이미징은 첫 번째 독소루비신 주사 후 1주 후에 마우스를 사용하여 수행되었습니다. 에 표시된 바와 같이 그림 3B, 심장 흡수는 Dox 단독 치료군보다 브레비스카핀 치료군에서 유의하게 더 높았으며, 이는 브레비스카핀 개입이 Dox로 유발된 심장 포도당 대사 감소를 역전시키고 심장 에너지 대사를 재구성할 수 있음을 시사합니다. 브레비스카핀 치료 후 심장 기능 및 병리학적 변화를 조사하였고, 임상약물인 dexrazoxane(Dexra)을 양성대조군으로 사용하였다. 심장초음파검사는 그림 3C Dox 그룹의 LVEF와 LVFS는 대조군에 비해 유의하게 낮았고, LVESV와 LVD는 대조군에 비해 유의하게 높았습니다. 이러한 결과는 Dox 치료 후 마우스의 좌심실 수축기 기능이 감소했으며 본 연구에서 Dox로 인한 심근 손상이 확장성 심근병증과 유사하다는 것을 시사합니다. Dox 감소된 수축기 기능은 이전에 보고된 것과 유사합니다(벤츄리니 외, 1996; 선 외, 2022). 독소루비신만 투여한 동물에 비해 Brev와 Dox를 투여한 동물의 심장에서는 모든 기능이 회복되었습니다. cTnI는 심근 손상의 바이오마커입니다.솔라로와 솔라로, 2020). cTnI의 농도는 doxorubicin 단독 투여군에서 대조군에 비해 유의하게 증가하였고, Brev의 농도를 다르게 했을 때 더 좋은 효과가 나타났다.그림 3D). 또한, 다양한 처리 후 병리학적 심장 조직의 염색을 통해 대조군 쥐의 심장 조직 구조가 정상임을 보여주었습니다. 대조군과 달리 Dox 그룹의 쥐는 괴사, 세포내 부종, 근섬유 장애 및 파열, 심장 섬유의 물결 모양 변성을 포함하여 많은 수의 심장 병변을 나타냈습니다. 흥미롭게도, 브레비스카핀을 사용한 전처치(preconditioning)는 이러한 유형의 손상을 예방하고 심장 지질의 과도한 축적을 완화하며 심근 항상성을 회복시켰습니다.그림 3F). 심근의 Masson 염색은 Dox 치료 후 간질성 섬유증이 유의하게 증가했으며 Brev 개입이 심장 섬유증의 정도를 감소시키는 것으로 나타났습니다.그림 3E). 심장 초음파 데이터에 따르면 LVESV 및 LVID는 대조군에 비해 Dox 군에서 유의하게 높았으며 이는 심실강 직경 확대를 시사하고 브레비스카핀 치료가 이러한 변화를 유의하게 완화할 수 있음을 나타냅니다. 이러한 결과는 브레비스카핀이 심장 대사를 재구성하고, 심장 포도당 흡수를 증가시키며, 심장 지방증을 감소시키고, 독소루비신에 의해 유발된 심장 기능 장애와 심근 형태의 변화를 완화할 수 있음을 시사합니다.

Breviscapine은 말초 혈청 수준과 심근 AKT 발현을 조절하여 심장 포도당과 지질 대사를 재구성합니다.

다음으로, 브레비스카핀이 당과 지방 대사의 균형을 어떻게 조절하는지 연구했습니다. 에 표시된 바와 같이 그림 4E, Breviscapine 처리 생쥐의 말초 혈청 세로토닌 수준은 Dox 처리 생쥐에 비해 급격하게 증가했으며, 감소 정도는 브레비스카핀 용량과 선형 관계를 나타내었으며 95% 이상 감소하는 것으로 나타났습니다. 고용량군에서 관찰됐다. 세로토닌(5-HT)은 신경 및 비신경 시스템에서 다양한 기능을 갖는 모노아민입니다.오카티 외, 2019). 중추신경계에서 5-HT는 기분과 섭식 행동을 조절하는 신경전달물질로 작용합니다.버거 외., 2009). 최근 연구에 따르면 말초 5-HT는 갈색 지방 조직에서 적응성 열 발생을 억제함으로써 말초 조직의 대사 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 5-HT 합성 억제는 식이 유발 비만 쥐 모델에서 체중 증가를 감소시키고 대사 기능 장애를 개선합니다.Zemdegs 등, 2016; Xia 외, 2021). 게놈 차원의 연관 연구에서도 세로토닌 시스템과 비만 사이의 유전적 연관성이 밝혀졌습니다. 세로토닌은 포도당 대사에 두 가지 다른 효과를 갖습니다. 즉, 췌장 B 세포에서 인슐린 분비를 직접 유도하여 혈당 수치를 낮추는 것입니다. 간과 골격근 이외의 조직이 혈액에서 포도당을 흡수하는 것을 억제하여 혈당 수치를 높입니다.와타나베 외, 2011; 카르미안 외, 2019; 야부트 외, 2019). 연구에 따르면 세로토닌 치료는 혈당 수치를 갑작스럽고 크게 증가시킬 수 있지만 세로토닌이 혈액에서 조직의 포도당 흡수를 어떻게 억제하는지는 불분명합니다. 우리의 실험 결과에 따르면 브레비스카핀 치료 후 말초 세로토닌 수치가 급격히 감소했으며 이는 심장 포도당 섭취량의 증가에 상응합니다.그림 4E), 간 포도당 섭취량은 크게 변하지 않았지만(보충 그림 S2) 및 공복 혈당(FBG) 수치가 감소했습니다(그림 4A). 브레비스카핀 그룹에서 5-HT를 추가로 보충하면 생쥐의 세로토닌 수치가 증가하고 심장 포도당 흡수가 감소했습니다.그림 4B). 세로토닌이 심근세포 대사를 조절하는 방법을 추가로 분석하기 위해 Dox 유발 심근 손상 모델 마우스에서 세로토닌 수준을 높이기 위해 5-HT를 추가한 다음 전사체 분석을 위해 마우스의 심장을 수집했습니다. 그 결과, Dox와 5-HT를 처리한 그룹의 지방산 산화가 Dox만 처리한 그룹보다 유의하게 높은 것으로 나타났습니다.보충 그림 S3). 그런 다음 우리는 포도당 흡수 조절에 중요한 역할을 하는 심근 포도당 대사의 중요한 조절자인 PI3K 단백질 키나제 B(Akt/PKB) 경로의 변화를 분석했습니다. 세포 분열, 증식 및 생존 촉진; 그리고 세포사멸을 억제합니다. 결과는 5-HT의 첨가가 Akt의 유전자 발현을 직접적으로 억제했지만 PI3K 촉매 서브유닛이나 조절 서브유닛 수준을 크게 변화시키지 않았음을 보여주었습니다.그림 4C). AKT의 손실은 심근세포의 포도당 대사 능력을 감소시킵니다. 이러한 결과는 브레비스카핀이 세로토닌 수준을 크게 감소시켜 조직의 포도당 흡수에 대한 세로토닌의 억제 효과를 완화하고 병리학적 상태에서 혈액에서 포도당의 흡수를 보장하여 신체가 심장 대사 조절에 참여할 수 있는 가능성을 나타냄을 시사합니다. 신경전달물질을 통한 리모델링. 더 중요한 것은, 중국에서 일반적으로 사용되는 심혈관 약물인 브레비스카핀은 말초 세로토닌 수준을 90% 이상 감소시킬 수 있으며 심근 포도당 대사로 인한 심근 비대 및 심부전 치료에서 고전적인 세로토닌 재흡수 억제제인 플루옥세틴보다 더 강력한 효과가 있다는 것입니다. Dox로 인한 심장 독성 치료를 위한 새로운 안전한 약제를 대표하는 장애 및 당뇨병. 역학 연구에서는 당뇨병이 Dox로 인한 심장 독성 위험을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 따라서 이 연구는 당뇨병과 암 환자에 대한 잠재적인 치료 전략을 제공합니다.창 외, 2021).

이러한 발견을 바탕으로 우리는 브레비스카핀이 포도당을 어떻게 조절하는지 조사했습니다. 마음으로 활용. 결과는 Dox에 노출된 생쥐에서 PI3K 단백질 발현이 유의하게 감소했으며 브레비스카핀 개입 후 심장 조직의 PI3K 단백질 발현 수준이 유의하게 증가했음을 보여주었습니다. 흥미롭게도 AKT 발현은 대조군과 Dox 노출군 모두에서 낮은 수준으로 유지되었으며, 브레비스카핀 치료 후에는 AKT 발현이 유의하게 증가한 것이 관찰되었습니다.그림 4D). 이전 연구에서는 AKT가 세포의 포도당 대사를 자극하여 포도당을 D-글루코스 6-인산으로 전환시키는 것으로 나타났습니다. ~을 통해 해당과정이나 글리코겐 중합을 위한 헥소키나제. 우리의 결과는 브레비스카핀이 심근 AKT의 발현을 촉진한 후 포도당 대사 관련 D-글루코스 6-인산 및 α-케토글루타르산 수치가 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다.그림 4F,G) 이는 브레비스카핀이 AKT를 통해 포도당을 에너지원으로 사용하는 심근의 능력을 향상시키고 포도당 이화작용을 촉진한다는 것을 시사합니다. 이전 연구에서는 PI3K-Akt 발현이 증가하면 말초 조직에서 당 활용을 촉진하고, 인슐린 저항성을 감소시키며, 심장 에너지 공급을 강화하고 심부전을 예방할 수 있는 반면, PI3K-Akt 경로를 억제하면 심장 세포의 생리적 활동에 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다.주 외., 2013). 이러한 결과는 브레비스카핀이 PI3K-Akt 경로의 활성화를 조절함으로써 Dox 유발 심근 손상에 대한 저항성을 향상시킨다는 것을 시사합니다. 이러한 결과는 브레비스카핀이 세로토닌을 억제하여 혈당 수치를 조절하고 심근 내 포도당 활용 제한을 차단하며 PI3K-Akt 경로를 활성화하여 심근 내 포도당 대사를 촉진한다는 것을 시사합니다. 따라서 세로토닌은 심장 당지질 대사를 조절하는 중요한 표적이 될 수 있습니다. 그런 다음 심근 당지질 대사의 리모델링에 따른 심장 기능 및 항상성의 변화를 분석했습니다. Dox 모델 그룹과 비교하여, 브레비스카핀 치료 그룹의 심근 ATP 생산은 유의하게 증가했습니다.그림 5A), FAO의 대사산물인 ROS와 MDA의 수준은 크게 감소했습니다(그림 5B,E). O2K 에너지 대사 분석에서는 브레비스카핀이 Dox 노출로 인한 심장 산소 소비의 극적인 증가를 억제하는 것으로 나타났습니다.그림 5C), ATP 생산/산소 소비 비율이 크게 감소했습니다(그림 5D), 미토콘드리아 막 전위를 표준화했습니다 (보충 그림 S4). 이는 브레비스카핀 치료가 고에너지 효율의 포도당을 에너지원으로 사용하는 심근의 능력을 증가시킨다는 것을 의미합니다. ATP 생산 효율성을 향상시킵니다. 심장 부하, 산화 스트레스 및 심근 산소 소비를 줄입니다. 결론적으로, 브레비스카핀은 세로토닌-혈당-심근 AKT 루프를 조절하고 심근 에너지 대사를 리모델링하며 포도당 활용을 증가시키고 FAO를 감소시킴으로써 Dox 노출로 인한 심장의 높은 산소 소비율과 부적절한 지질 연소의 악순환을 효과적으로 끊을 수 있습니다. (그림 5F), DIC의 추가 개발을 방해합니다.

Breviscapine은 PINK1/Parkin 신호 전달 경로를 통해 Dox 치료 후 미토콘드리아 손상을 제거하고 심근 항상성을 회복합니다.

DIC의 메커니즘에 관한 가설은 지난 수십 년 동안 다양했지만 DIC의 주요 특징은 산화환원 불균형과 미토콘드리아 기능 손상입니다. 결과는 이전에 심장 에너지 비율과 에너지 출력 효율성의 관점에서 DIC 개발 가설을 개선하는 것을 방해했지만 브레비스카핀이 어떻게 미토콘드리아 이후 심장의 대사 네트워크를 최적화하여 효율적인 에너지 생산과 심장 미세환경 항상성을 달성하는지에 대한 중요한 질문을 제기합니다. 부상. 따라서 우리는 이 질문에 답하는 것을 목표로 삼았습니다. Pten에 의해 유도된 추정 키나아제1 PINK1/Parkin 신호 전달 경로는 미토콘드리아 자가포식에 의해 매개되는 주요 경로 중 하나이며 심근세포의 에너지 대사를 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.Dewanjee 외, 2021). 심근세포의 미토콘드리아가 손상되면 미토콘드리아 품질 관리 시스템의 '감시원'인 PINK1이 미토콘드리아 외막에 축적되어 파킨(Parkin)을 수집하고 인산화시킨다.풀과 매클라우드, 2021). 활성화된 파킨은 손상된 미토콘드리아를 유비퀴틴화한 다음 리소좀과 융합하여 분해를 완료합니다. PINK1/Parkin 신호 전달 경로에 의해 매개되는 강화된 미토콘드리아 자가포식은 심근세포의 미토콘드리아 항상성을 유지하고 심장 질환의 진행을 늦출 수 있습니다.도른, 2016).

따라서 우리는 브레비스카핀이 PINK1/Parkin 경로를 통해 미토콘드리아 자가포식을 강화하고 심근세포에서 미토콘드리아 항상성을 유지한다고 추측했습니다. WB는 Dox 투여군에 비해 브레비스카핀 투여군에서 PINK1/Parkin의 총 단백질 발현 수준이 유의하게 증가한 것을 보여주었다.그림 6A), 해당 인산화 수준도 크게 증가했습니다(그림 6B). Dox 처리군에서는 PINK1/Parkin 단백질 발현이 감소하는 경향을 보였으며, 단백질 인산화가 유의하게 감소한 반면, 미토콘드리아 막 단백질 Tom20의 수준은 증가하여 Dox가 미토콘드리아 손상을 유발하더라도 손상된 단백질의 적시 제거를 억제함을 시사합니다. 미토콘드리아. Dox 그룹에서는 다수의 부서지고 손상된 미토콘드리아가 관찰되었습니다(빨간색 화살표, 그림 6D), Brev 그룹에서는 다량의 리소좀으로 둘러싸인 미토콘드리아 자가포식이 관찰되었습니다(파란색 화살표). Dox와 Brev를 동시에 적용한 경우 미토콘드리아 능선이 뚜렷하고 미토콘드리아 형태가 정상이며 막 구조가 손상되지 않았습니다. MitoTracker로 염색했을 때 Dox 그룹에서 가장 높은 형광 강도가 발견되었습니다(그림 6C), 이는 대조군과 Brev 그룹보다 Dox 그룹에 훨씬 더 많은 미토콘드리아가 있음을 나타냅니다. 더욱이, 항산화 단백질인 NADH와 SOD의 수준은 Brev 치료 후에 유의하게 증가했습니다.보충 그림 S5). 에너지 수용체 AMPK의 인산화는 Dox 그룹에 비해 Brev 치료 그룹에서 크게 감소한 반면, 세포 성장 조절 센터는 활성화되었습니다.그림 6E). 이러한 결과는 Dox 노출이 심근 손상, 미토콘드리아 축적 및 항상성 불균형을 유발한다는 것을 나타내며, 이는 Dox 투여 후 심장 에너지 출력 효율이 감소하고 산화 스트레스가 증가하는 이유를 어느 정도 설명합니다. 브레비스카핀은 미토콘드리아 자가포식을 촉진하고, 손상된 미토콘드리아를 제거하며, 심근 항상성을 회복하여 심장 ATP 생산과 산화 스트레스 사이의 동적 균형을 효과적으로 보장할 수 있습니다.

브레비스카핀의 이러한 효과가 Mdivi-1에 의해 차단되었을 때 심근세포의 ROS 수준이 크게 증가했습니다.그림 6F), ATP 생산량이 크게 감소한 반면(그림 6G). 또한 심근세포의 생존율도 감소하였다(보충 그림 S6), 심근세포에 대한 브레비스카핀의 회복 효과가 억제되었습니다. Dox와 Mdivi-1을 결합하면 ATP 생산과 심근세포의 생존율이 더욱 감소하고 ROS 수준이 증가하며 심근 손상이 악화됩니다. 이러한 결과는 미토콘드리아 자가포식이 Dox 유발 심근세포 손상에 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 심장의 대사 네트워크 리모델링만으로는 미토콘드리아 손상으로 인한 기능 장애를 완전히 상쇄할 수 없으며, 브레비스카핀의 심근 보호 효과는 포도당 및 지질 대사 조절과 미토콘드리아 자가포식 활성화에 달려 있습니다. 이는 또한 DIC 발달 가설과 관련하여 심장 대사 네트워크의 조절이 고려되지 않은 이유일 수도 있습니다. Dox로 인한 심장 기능 장애 및 심부전 증상의 치료에서는 질병의 진행을 예방하고 심장 기능을 회복하는 것이 똑같이 중요해야 환자의 예후와 삶의 질에 더 유익할 것으로 제안됩니다.

저자는 원본 초안 준비 및 데이터 큐레이션에 대해 중국 칭다오대학교 부속병원 암연구소 W-SS에 감사드립니다.