반응 표면 방법론을 통한 Herba Polygoni Capitati의 퀘르시트린 및 총 플라보노이드 추출 최적화

샘플 준비

허바폴리고니카피타티 분말 2g을 정밀히 달아 일정한 조건에서 추출한 후 3500℃에서 원심분리하였다. rpm 10분 동안. 후속 분석을 위해 상청액을 수집하고 여과지를 통해 여과했습니다.

기구

본 연구에 사용된 분석 시스템은 다음과 같습니다. UV-Vis 스펙트럼은 경로 길이가 1cm인 셀을 사용하여 이중 빔 분광 광도계(Cary 100-Varian)에서 기록되었습니다. 진공 탈기 장치, 4차 펌프, 자동 샘플러, 온도 조절 컬럼 구획 및 DAD 검출기로 구성된 DIONEX/UltiMate 3000 시리즈 UHPLC-DAD 시스템(DIONEX, ThermoFisher, Sunnyvale, USA)을 사용하여 크로마토그램을 획득했습니다.

총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량(TFC)은 이전에 설명한 알루미늄 비색법에 따라 결정되었습니다.25,26,27,28] 수정했습니다. 간략하게 말하면, 각 식물추출물 0.5ml를 관련용매 4.3ml와 혼합한 후, 10% 염화알루미늄(AlCl) 0.1ml를 첨가하였다.₃) 및 1M 아세트산나트륨(CH) 0.1ml₃ 쿠나). 루틴(Rutin)을 참조 표준으로 사용했습니다. 실온에서 30분 동안 배양한 후, 반응 혼합물을 블랭크에 대해 405nm에서 측정했습니다. 각 샘플의 TFC 값을 계산하고 건조된 물질 그램당 루틴 당량의 밀리그램(DM)으로 표시했습니다.

크로마토그래피 분리

추출물의 HPLC 분석은 DIONEX/UltiMate 3000 시리즈를 사용하여 수행되었습니다. 분리는 ZORBAX SB-C에서 수행되었습니다.₁₈ 유속 1.0ml/min의 컬럼(150mm × 4.6mm, 5μm, Agilent, CA, USA). 이동상은 A(아세토니트릴)와 B(물 중 0.2% 포름산)의 조합으로 구성되었습니다. 선형 구배는 5%에서 15% A(v/v) 5분에 16% A로, 10분에 16%A로, 20분에 20%A로, 이어서 20%A로 22분 동안 유지했습니다. 각 실행 후에는 5분의 평형 시간이 소요되었습니다. UV 검출기의 파장은 260nm로 설정되었고, 컬럼 오븐의 온도는 30°C로 유지되었습니다. 주입 전에 샘플을 여과했습니다 (PTFE 주사기 필터; 0.45 μm; Hanbon Ltd, China; 013045). 데이터는 Chromeleon 7.1 소프트웨어를 사용하여 수집 및 분석되었습니다.

표준 용액의 준비

루틴과 퀘르시트린의 표준 원액은 각각 190.8μg/ml 및 106.0μg/ml의 농도로 메탄올에서 제조되었습니다. 피크 면적과 흡광도로부터 각각 도출된 선형 최소 제곱 회귀 방정식을 사용하여 퀘르시트린과 TF의 표준 곡선을 보정하고, 표준 곡선에 따라 시료 내 퀘르시트린과 TF의 농도를 계산했습니다.

적절한 추출 조건 선택

RSM을 사용하여 연구를 개발하기 전에 관련 독립 변수를 선택하고 실험 범위를 결정하기 위해 일련의 예비 테스트를 수행했습니다. 예비 실험의 첫 번째 단계는 Herba Polygoni Capitati의 추출에 적합한 방법을 선택하는 것이었습니다. 세 가지 다른 접근법, 즉 침용, 환류 및 초음파 추출 추출을 테스트했습니다. 예비 실험의 두 번째 단계는 Herba Polygoni Capitati에 적합한 추출 용매를 선택하는 것이었습니다. 0-100%(수중 에탄올 또는 메탄올) 범위의 다양한 추출 용매를 사용하여 최상의 용매를 결정했습니다. 셋째, 용매-재료 비율(6:1, 8:1, 10:1, 12:1, 14:1; v/m) 추출에 대한 조사는 에탄올:물(70:30, v/v)을 용매로 사용하여 실온에서 30분 동안 초음파 추출을 추출했습니다. 넷째, 추가 조사를 위해 적절한 입자 크기를 선택했습니다. 마지막으로 추출 시간(10분, 20분, 30분, 40분, 50분, 60분)도 테스트했습니다.

이러한 결과를 바탕으로 중심합성설계(CCD)를 위한 각 관련변수의 3개 수준(하위, 중간, 상위)을 선정하여 반응패턴을 분석하고 모형을 구축하였다.

매개변수 결정 및 수준 선택

 

추출 방법의 효과

침연, 환류 및 초음파 처리 추출을 포함한 세 가지 추출 방법을 다음 매개변수 값으로 테스트했습니다: 입자 크기, 10 메쉬; 용매-재료 비율, 10:1(ml/g); 추출 기간, 환류 및 초음파 추출 추출에 30분, 침연 추출에 12시간; 용매 조성물, 70% 수성 에탄올; 온도, 실내 온도. DM 1g당 추출된 퀘르시트린과 TF의 양은 다음과 같습니다. 그림 2. 실험 결과에 대한 ANOVA는 세 가지 추출 방법 간에 유의미한 차이를 보여주었습니다(피 < 0.01). 한편, 초음파 추출 방법은 퀘르시트린과 TF의 수율이 가장 높아 추출 방법으로 선택되었습니다.

그림 2

Herba Polygoni Capitati에서 퀘르시트린(왼쪽)과 TF(오른쪽)를 추출하는 다양한 방법의 효과

 

추출 용매의 영향

용매는 분석물질의 회수에 영향을 미치는 핵심 요소입니다. 본 연구에서는 물, 다양한 농도의 메탄올 및 다양한 농도의 에탄올을 테스트했습니다. 에 표시된 바와 같이 그림 3, 60% 수성 에탄올의 추출 효율이 가장 높았다. 따라서 추가 RSM 조사를 위해 용매 조성의 하위, 중간 및 상위 수준으로 50%, 60% 및 70% 에탄올을 선택했습니다.

그림 3

Herba Polygoni Capitati에서 초음파를 이용한 케르시트린 및 TF 추출에 대한 용매 조성의 영향

 

용매-재료 비율

추출에 대한 용매-재료 비율의 영향은 5가지 값(6:1, 8:1, 10:1, 12:1, 14:1; v/m). 적합한 용매-재료 비율 값은 규칙에 따라 선택됩니다.29] 그 값은 너무 작거나(생리 활성 화합물을 완전히 추출할 수 없음) 너무 높아서는 안 됩니다(처리 비용이 감당할 수 없을 정도로 높음). 제시된 바와 같이 그림 4, 퀘르시트린과 TF 수율의 증가 추세가 관찰되었으며 비율이 약 10:1일 때 가장 높은 값에 도달했습니다. 가능한 설명은 용매-물질 비율의 증가가 용매의 세포 내 확산성을 증가시키고 세포로부터 페놀성 화합물의 탈착을 향상시킬 수 있다는 것입니다.30] 본 연구에서는 비율 값이 10:1보다 높을 때 퀘르시트린과 TF 수율이 약간 감소하는 것으로 나타났는데, 이는 제품 수집이나 공정 운영 시 손실이 더 크기 때문일 수 있습니다. 따라서 후속 연구에서는 용매-재료 비율을 RSM의 중간 수준으로 10:1로 설정했습니다.

그림 4

퀘르시트린 및 TF 수율에 대한 용매-재료 비율의 영향

 

입자 크기의 영향

입자 크기는 고려해야 할 또 다른 중요한 변수입니다. 일반적으로 추출효율은 입자크기가 작을수록 증가한다.그림 5]. 본 연구에서는 입자 크기를 직경 0.45~0.9mm로 설정했습니다.

그림 5

퀘르시트린 및 TF의 수율에 대한 입자 크기의 영향

 

추출 시간의 영향

적절한 추출 시간을 선택하는 것이 예비 연구의 마지막 단계였습니다. 최적의 값을 조사하기 위해 10, 20, 30, 40, 50 및 60분의 다양한 추출 길이를 테스트했습니다. 그 결과, 추출시간이 10분에서 50분으로 길어질수록 퀘르시트린과 TF의 수율이 증가하는 것으로 나타났다.그림 6]. 50분 수준에서 퀘르시트린과 TF 수율이 가장 높은 수준에 도달했습니다. 따라서 추출 시간의 하위, 중간, 상위 수준으로 40분, 50분, 60분을 선택하였다.

그림 6

추출 시간이 퀘르시트린 및 TF 수율에 미치는 영향

RSM을 통한 추출 매개변수 최적화

 

다중선형회귀 결과 및 적합모델의 적합성 분석

20개의 실험 실행으로 구성된 3요소 및 3단계 회전 가능 CCD가 중심점에서 6번의 반복실험으로 사용되었습니다. 실험 순서를 무작위로 지정하여 설명되지 않는 변동성의 영향을 최소화했습니다. 독립 변수는 용매 조성(X₁, %, v/v, 에탄올/물), 용매-재료 비율(X₂, ml/g) 및 추출 시간(X₃, min) 퀘르시트린과 TF 수율을 지표로 사용합니다. 고정된 입자 크기(0.45-0.9mm)가 선택되었습니다. 모든 실행의 퀘르시트린 및 TF 수율은 다음과 같습니다. 1 번 테이블. 이러한 결과를 바탕으로 2차 다항식 모델(Eq. (1))을 이용한 다중 선형 회귀를 수행하였다.

 

1 번 테이블

독립 변수(X)의 원래 형식과 코드화된 형식으로 회전 가능한 중심 합성 설계 설정₁, 엑스₂, 엑스₃) 및 반응 변수인 퀘르시트린과 TF에 대한 실험 결과

독립 변수의 ANOVA는 다음과 같습니다. 표 2 이는 이 세 가지 독립 변수가 모두 추출 효율에 큰 영향을 미친다는 것을 나타냅니다(피 < 0.05). 다중 결정의 해당 계수를 사용하여 피팅된 2차 모델의 회귀 매개변수(아르 자형²)에 표시되었습니다. 표 3. 좋은 피팅이 달성되었으며 응답의 가변성이 모델에 의해 설명되었습니다. 높은 아르 자형² 퀘르시트린과 TF에 대해 각각 0.94와 0.96의 값은 실험 데이터가 모델에 의해 예측된 데이터와의 호환성을 확인했음을 의미합니다. 변동 계수의 낮은 값(퀘르시트린의 경우 1.92%, TF의 경우 3.28%)은 적합 모델에서 얻은 결과가 신뢰할 수 있음을 나타냅니다. 조정된 결정계수(아르 자형² Adj.) 값은 포함된 모든 *유의적인 용어와 높은 값을 사용하여 표현식을 재구성합니다. 아르 자형² 조정 (아르 자형² 조정 각각 87%, 92%와 같음)는 모델의 중요성을 뒷받침합니다.

 

표 2

반응 표면 2차 모델의 분산 분석

표 3

반응 변수인 퀘르시트린과 TF에 대한 예측된 2차 모델의 회귀 계수

적합성 결여 테스트는 모델 적합도의 적절성을 확인하는 데 사용되었습니다. 적합성 결여 테스트에 대한 ANOVA는 퀘르시트린 및 TF 수율과 관련하여 유의미하지 않았습니다(피 > 0.05), 이는 모델이 실험 데이터에 적절하게 적합할 수 있음을 나타냅니다.표 4].

 

표 4

퀘르시트린 및 TF에 대한 적합성 테스트 부족에 대한 분산 분석

 

반응 표면 분석

부터; 모델이 좋은 피팅을 보여주고, 응답 값은 회귀 방정식으로 충분히 설명됩니다. 독립 변수의 상호 작용을 보여주고 최대 반응에 대한 각 독립 변수의 최적 값을 결정하기 위해 반응 표면 곡선을 플롯했습니다. 독립변수와 종속변수 사이의 관계는 3차원(3D) 반응 표면 플롯과 2차원(2D) 등고선 플롯으로 설명되었습니다. 회귀식을 그래픽으로 표현한 3차원 반응표면과 2차원 등고선도를 제공하였다. ​[그림77 그리고 ​그리고8].8]. 각 등고선 곡선은 다른 독립 변수를 고정점에 유지하면서 두 독립 변수의 무한한 조합 수를 나타냅니다. 이러한 방식으로 3D 응답 표면을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 그림 7a 은 용매 조성과 용매-물질 비율에 대한 모델을 통해 개발된 3차원 반응 표면 함수를 보여줍니다. 용매 조성은 반응에 대한 2차 효과를 보여주었습니다. 퀘르시트린의 함량은 65% 에탄올을 사용할 때 가장 높은 값에 도달합니다. 마찬가지로, 용매-재료 비율은 동시에 퀘르시트린에 대한 2차 효과를 보여주었습니다. TF에 대한 용매 조성 및 용매-재료 비율의 영향 결과는 다음과 같습니다. 그림 8a. 용매 조성은 60%와 70% 에탄올 사이에서 최대값을 산출하는 반응에 대해 2차 효과를 나타냈습니다. 마찬가지로, 용매-물질 비율이 증가함에 따라 용매 조성이 고정되면 TF는 점차 증가하여 용매-물질 비율이 약 10:1일 때 가장 높은 값에 도달했습니다.

그림 7

용매 조성(X1), 용매 물질 비율(X2) 및 추출 시간(X3)이 퀘르시트린 수율에 미치는 영향을 보여주는 반응 표면 플롯(a, c 및 e) 및 등고선 플롯(b, d 및 f)

그림 8

TF 수율에 대한 용매 조성(X1), 용매 재료 비율(X2) 및 추출 시간(X3)의 영향을 보여주는 반응 표면 플롯(a, c 및 e) 및 등고선 플롯(b, d 및 f)

퀘르시트린 및 TF 수율의 반응 값에 대한 독립변수 용매 조성 및 추출 시간의 효과가 그림에 표시되어 있습니다. ​그림7c,7c, ​,7일,7일, ​,8c,8c, ​,8d,8일, 각각. 두 독립변수 사이의 상호작용 관계는 다른 독립변수인 용매-물질 비율을 정지점에서 일정하게 유지하여 생성된 등고선 플롯을 살펴보면 쉽게 이해할 수 있다. ​[그림7d7일 그리고 ​그리고 8d].8일]. 용매 조성 및 추출 시간이 증가할수록 퀘르시트린과 TF의 수율은 유의하게 증가하였다. 그러나 독립 변수가 특정 값을 초과하면 퀘르시트린과 TF 수율이 더 이상 증가하지 않습니다. 용매 조성과 추출 시간의 상호작용은 퀘르시트린 수율에 영향을 미치는 데 통계적으로 유의하지 않았지만,피 < 0.01) TF 추출에 미치는 영향.

피규어 ​그림7e7e 그리고 ​그리고8e8e 퀘르시트린과 TF의 수율에 대한 용매-재료 비율과 추출 시간의 영향을 입증했습니다. 추출 시간과 용매-물질 비율이 증가함에 따라 퀘르시트린과 TF의 수율이 증가하는 것으로 나타났는데, 이는 퀘르시트린과 TF의 추출 수율이 추출 시간과 용매-물질의 비율에 비례함을 의미한다. Herba Polygoni Capitati로부터 퀘르시트린과 TF 추출에 대한 두 독립변수의 상호작용은 통계적으로 유의하지 않았습니다.

저자들은 구이저우성 주요 과학 기술 특별 프로그램(2011-6019-02), 구이저우성 의약품 분석 과학 기술 혁신 인재 팀 프로그램(No. 2011 6019-02)의 원료 및 재정 지원을 제공한 Guizhou Warmen Pharmaceutical Corporation에 감사드립니다. . 2011 4008), 한의학 현대화에 관한 과학 기술 산업 연구 및 개발에 관한 구이저우성 특별 프로그램(No. ZY 2011 3013), 한의학 및 민족 의학 표준화의 특성 핵심 연구소 및 구이저우 특성 핵심 연구소 지방 교육부. (번호 KY 2012 005).