La breviscapina remodela el metabolismo de la glucosa y los lípidos del miocardio mediante la regulación de la serotonina para aliviar la cardiotoxicidad inducida por la doxorrubicina

Meng-Jiao Li, 1, 2, † Wen-She Sun, 1, † Yang Yuan, 1, † Yu-Kun Zhang, 1, 2 Qi Lu, 1, 2 Yuan-Zhen Gao, 1, 2 Ting Ye, 1 , 2 y Dong-Ming Xing autor correspondiente 1, 3,*

Abstracto

Objetivos: El fármaco anticancerígeno de amplio espectro doxorrubicina (Dox) se asocia con una alta incidencia de cardiotoxicidad, lo que afecta gravemente la aplicación clínica del fármaco y la calidad de vida de los pacientes. Aquí evaluamos cómo Dox modula la energía miocárdica y la función contráctil y esto podría ayudar al desarrollo de fármacos protectores relevantes.

Métodos: Los ratones fueron sometidos a tratamiento con doxorrubicina y breviscapina. La función cardíaca se analizó mediante ecocardiografía y la señalización mediada por Dox se evaluó en cardiomiocitos aislados. Se evaluaron las acciones cardioprotectoras y antitumorales duales de la breviscapina en modelos de tumores de mama en ratones.

Resultados: Descubrimos que Dox altera el metabolismo energético del miocardio al disminuir la absorción de glucosa y aumentar la oxidación de los ácidos grasos, lo que lleva a una disminución en la tasa de producción de ATP, un aumento en la tasa de consumo de oxígeno y estrés oxidativo, y mayores déficits energéticos para mejorar la absorción de ácidos grasos del miocardio e impulsar la CID. desarrollo. Curiosamente, la breviscapina aumenta la eficiencia de la producción de ATP y restablece la homeostasis energética del miocardio mediante la modulación del circuito serotonina-glucosa-miocardio PI3K/AKT, aumentando la utilización de glucosa por el corazón y reduciendo la oxidación de lípidos. Mejora la autofagia mitocondrial. a través de la vía PINK1/Parkin, elimina la acumulación mitocondrial dañada causada por Dox, reduce el grado de fibrosis e inflamación cardíaca y restaura la homeostasis microambiental cardíaca. Es importante destacar que sus bajos niveles de inflamación reducen la infiltración de células inmunosupresoras mieloides, y este efecto es sinérgico con el efecto antitumoral de Dox.

Conclusión: Nuestros hallazgos sugieren que la alteración de la red metabólica cardíaca por Dox es un factor importante de su cardiotoxicidad y que la serotonina es un regulador importante del metabolismo de la glucosa y los lípidos del miocardio. La homeostasis energética del miocardio y la eliminación oportuna de las mitocondrias dañadas contribuyen sinérgicamente a la prevención de la cardiotoxicidad inducida por antraciclina y mejoran la eficiencia del tratamiento tumoral.

Palabras clave: doxorrubicina, DIC, breviscapina, serotonina, PINK1/Parkin

Introducción

El antibiótico antraciclina doxorrubicina (Dox) es un agente anticancerígeno muy eficaz para el tratamiento de tumores sólidos, leucemias, linfomas y cáncer de mama (). El uso de Dox puede provocar una miocardiopatía progresiva, crónica y potencialmente mortal conocida como miocardiopatía inducida por Dox (CID) (). En particular, en pacientes con cáncer, el riesgo de muerte por cardiotoxicidad relacionada con los fármacos supera el riesgo de muerte por el propio tumor o recurrencia.). La CID resultante de la cardiotoxicidad puede ocurrir después de la administración de dosis bajas de Dox dependiendo de la susceptibilidad del individuo (). Los estudios epidemiológicos han demostrado que las anomalías metabólicas, como la obesidad, la diabetes y las enfermedades hepáticas, conducen a un mayor riesgo de CID y que Dox reduce considerablemente la absorción de glucosa por el corazón, lo que sugiere que Dox puede afectar el desarrollo de CID al alterar la Microambiente metabólico del corazón. Recientemente, los estudios sobre los posibles mecanismos moleculares de la CID se han centrado en el desequilibrio de la homeostasis del buey rojo, la inhibición de la transcripción por la topoisomerasa IIβ (Top2b), la disfunción mitocondrial y el calcio.2+-manejo de anomalías (). El corazón consume la mayor cantidad de energía del cuerpo y Dox remodela el metabolismo cardíaco. Sin embargo, las alteraciones que impulsan el desarrollo de la CID no se comprenden completamente. No se han establecido estrategias terapéuticas para prevenir la CID mediante la regulación de las redes metabólicas cardíacas.

El metabolismo energético cardíaco implica conjuntos intrincados de vías interactivas que resultan en el uso del sustrato energético de cada clase para la producción o biosíntesis de ATP. La característica más destacada de la red es la flexibilidad metabólica demostrada en respuesta a diversos estímulos, incluidos cambios en el desarrollo, estado nutricional, condiciones fisiopatológicas crónicas e intervenciones farmacológicas.). Las mitocondrias, que son orgánulos multipropósito que representan un tercio del volumen de los cardiomiocitos y no solo generan más de 95% del ATP utilizado por el corazón, sino que también regulan la homeostasis del calcio intracelular, la transducción de señales y la muerte celular, son fundamentales para la energía coordinada. transducción (). Aunque el corazón es capaz de utilizar todo tipo de sustratos energéticos, incluidos carbohidratos, lípidos, aminoácidos y cuerpos cetónicos, para la producción de ATP, el sustrato utilizado afecta la eficiencia cardíaca. Las concentraciones elevadas de ácidos grasos y la oxidación se asocian con una disminución de la oxidación de la glucosa en el contexto de la obesidad y la diabetes (). La disfunción cardíaca se asocia con un mayor consumo de oxígeno del miocardio, una reducción de la eficiencia cardíaca y un aumento del estrés oxidativo, lo que sugiere que el aumento de la oxidación de ácidos grasos (FAO) es perjudicial para la función cardíaca.). Un mecanismo que subyace a los efectos adversos del alto nivel de FAO es la disminución de la eficiencia del oxígeno y un aumento en los niveles de derivados de ácidos grasos, que pueden reducir aún más la eficiencia al desacoplar las mitocondrias. De hecho, la elevación de la peroxidación lipídica (LP) se observa en la CID, lo que sugiere que la FAO elevada puede ser una vía clave para la lesión cardíaca. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la remodelación metabólica cardíaca durante el tratamiento con Dox aumenta la absorción y oxidación de ácidos grasos, lo que resulta en una baja eficiencia de producción de ATP, acompañada de un alto consumo de oxígeno y estrés oxidativo, y que la eficiencia cardíaca reducida, a su vez, se retroalimenta para una mayor utilización de ácidos grasos. y daño mitocondrial, que a su vez acelera la progresión de la CID.

Curiosamente, los estudios epidemiológicos sugieren que el consumo regular de alimentos ricos en flavonoides puede reducir el riesgo de muchas enfermedades cardiovasculares, y se ha demostrado que muchos compuestos flavonoides naturales protegen la función cardíaca (). Erigeron breviscapus, también conocido como Asherpa breviscapina o Apocynum, es una hierba tradicional que se utiliza desde hace más de 600 años. La breviscapina es un componente flavonoide de Erigeron breviscapus que tiene una amplia gama de efectos farmacológicos, como efectos antioxidantes, antiinflamatorios y antitumorales (). La inyección de breviscapina es el fármaco clásico más utilizado para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares en China, y también es un fármaco importante para el tratamiento de emergencia en los hospitales chinos. La breviscapina se ha aplicado clínicamente para el tratamiento de la hipertensión, la embolia cerebral y las enfermedades cerebrovasculares durante más de 20 años (). Sin embargo, actualmente no existen informes sobre su efecto protector contra las lesiones cardíacas causadas por los fármacos de quimioterapia.

En este estudio, exploramos los efectos potenciales de la breviscapina sobre la CID y sus posibles mecanismos moleculares mediante el establecimiento de un modelo de lesión miocárdica inducida por antraciclina utilizando cardiomiocitos de rata H9c2 y ratones C57BL/6. También dilucidamos sistemáticamente que la breviscapina puede mejorar la eficiencia de utilización de la glucosa del miocardio a través de la vía de la serotonina ramificada regulada por la glucosa, ejerciendo así funciones similares a la insulina para lograr una alta eficiencia de producción de ATP y bajos niveles de estrés oxidativo durante un menor consumo de oxígeno, y puede activar el mecanismo clásico. vía autofágica mitocondrial PINK1/Parkin para eliminar la acumulación de mitocondrias dañadas inducida por Dox, coordinar la regulación del estrés oxidativo y la producción de energía y restaurar gradualmente la homeostasis del microambiente cardíaco. Se cree que la breviscapina es un nuevo agente protector potencial para la cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina.

Materiales y métodos

Todos los estudios con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con las directrices del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Qingdao.

reactivos

Se utilizaron los siguientes reactivos: DMEM, FBS, penicilina/estreptomicina (Meilunbio, Dalian, China), kits cTnI Elisa (Sangon Biotech, Shanghai, China), kits TNF-α, IL-1β e IL-6 Elisa (MyBioSource, San Diego, Estados Unidos), kits de MDA, kits de SOD y kits de NADH (Solarbio, Beijing, China), kits de CCK-8 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China), kits de fluorimetría de ROS, tinte fluorescente JC-1, kits de extracción de proteínas y kits BCA (Meilunbio, Dalian, China). IL-1 (1:100), PINK1(1:1.000), Parkin (1:1.000), AMPK(1:1.000), Akt (1:1.000), P13K(1:1.000), Tom20 (1:1.000) , β-tubulina (1:1000), mTOR (1:1000) y un anticuerpo GAPDH conjugado con HRP (1:1000) se obtuvieron de Abclonal Biotechnology (Wuhan, China). El tampón de lisis RIPA y el tampón de carga se adquirieron en Meilunbio (Dalian, China). Las membranas de PVDF se obtuvieron de Merck (Nueva Jersey, Estados Unidos). DMSO se adquirió de Macklin (Shanghai, China), y doxorrubicina, breviscapina y dexrazoxano se adquirieron de Widely (Wuhan, China). El inhibidor Mdivi-1 se adquirió de Selleck Chemicals (Houston, Estados Unidos).

Condiciones de cultivo celular y líneas celulares.

El medio de cultivo y los suplementos para el cultivo celular se adquirieron en Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, Estados Unidos), y los materiales de plástico se adquirieron en Corning (Corning, NY, Estados Unidos). Se cultivaron células de cardiomioblasto embrionario de rata H9c2 derivadas de corazón de rata (ATCC, CRL-1446) en DMEM que contenía suero bovino fetal 10%, 100 unidades/ml de penicilina G sódica y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina (37°C, 5% CO2). Se cultivaron células de cáncer de mama metastásico humano MCF-7 (iCell, iCell-h129) en 1.640 medios suplementados con suero bovino fetal 10%, 100 unidades/ml de penicilina G sódica y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina. Se cultivaron células de cáncer de mama de ratón 4T1 (ATCC, FS-0158) en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, 100 unidades/ml de penicilina G sódica y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina.

Las células se pasaron regularmente cuando alcanzaron la confluencia 80–90% y se sembraron en placas de 96 pocillos (1 × 104 células/pozo). Las células H9c2 se expusieron al control, Dox 5 μM (), Dox 5 µM + Dexra 20 µM (), o 5 μM Dox+200 μM breviscapina () durante 24 h, respectivamente. Las células tratadas solo con DMEM se usaron como controles en blanco y se usó Dexra como control positivo. Finalmente, también inyectamos Mdivi-1 (5μM, en DMSO), un inhibidor de la división mitocondrial ().

Evaluación del estrés oxidativo.

Los niveles de ROS intracelulares se midieron utilizando el colorante fluorescente DCFH-DA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se preparó una solución DCFH-DA (1 μM) en PBS y se añadió a células H9c2 cultivadas en una placa de 6 pocillos antes de la incubación a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS. Se tomaron fotomicrografías fluorescentes con un aumento de 20 × utilizando un microscopio de fluorescencia de Leica Microsystems, Ltd. Los niveles de ROS se cuantificaron con un citómetro de flujo Beckman (Beckman, California, Estados Unidos).

Determinación de índices enzimáticos.

La actividad de SOD y NADH se midió utilizando un kit de ensayo de actividad según las instrucciones del fabricante. La absorbancia y la luminiscencia se midieron utilizando un lector de microplacas (Perkin Elmer, Massachusetts, Estados Unidos).

Microscopio de electrones

Las células se fijaron con fijador de glutaraldehído 0,51 TP3T a 4 ° C durante 15 a 30 minutos y se recogieron mediante centrifugación a 10.000 a 13.000 rpm durante 5 minutos. Las células se fijaron adicionalmente con glutaraldehído 3% a 4 °C durante la noche y luego se trataron con tetróxido de osmio 1% a temperatura ambiente durante 2 h. Posteriormente, las muestras se deshidrataron en un gradiente de acetona, se incluyeron en Epon 812, se sometieron a posicionamiento óptico y se cortaron en secciones ultrafinas. Las secciones se tiñeron doblemente con acetato de uranilo y citrato de plomo. La ultraestructura mitocondrial se examinó utilizando un microscopio electrónico de transmisión H-7650 (Hitachi, Toyko, Japón).

Determinación de la respiración mitocondrial.

Aproximadamente 106 Se utilizaron células para medir la respiración mitocondrial con un respirómetro O2K (Oroboros Instruments, Austria). La concentración de oxígeno se determinó y analizó utilizando el software Oroboros DatLab 7.4. En resumen, se registró un estado respiratorio de fuga solo en las células, la transferencia de electrones se acopló a la fosforilación mediante la adición de ADP 5 mM y se registró la respiración del estado 3 respaldada por el complejo I. La respiración en el estado máximo 3 con entrada de electrones paralela desde el complejo I y el complejo II se registró mediante la adición de succinato 10 mM, y la respiración asistida por el complejo II se midió en presencia de rotenona 6,25 µM. La capacidad máxima de transferencia de electrones se registró en presencia de cianuro de carbonilo p-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) 5 µM. Finalmente, se administró antimicina (Ama), que completa el complejo Ⅲ y bloquea todo el transporte de electrones, y la tasa de consumo de oxígeno se midió como consumo de oxígeno no mitocondrial.

Determinación de cambios en el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)

Se utilizó tinción con yoduro de 5,5 ′, 6,6′-tetracloro-1,1 ′, 3,3′-tetraetilbencimidazolilcarbocianina (JC-1) para evaluar el potencial de membrana mitocondrial en células H9c2. Brevemente, de acuerdo con las condiciones experimentales predeterminadas, las células H9c2 se lavaron con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) tibia antes de teñirlas con 100 μl de solución JC-1 2 μM (mezclada en DMEM sin rojo de fenol) y se incubaron en cultivo celular estándar. condiciones durante 30 min en la oscuridad. Después de la incubación, las células se lavaron con DPBS tibio y se tomaron fotomicrografías de fluorescencia con un aumento de 20X utilizando un microscopio de fluorescencia invertido Leica Microsystems CMS GmbH (Leica Camera AG, Barnack, Alemania).

inmunofluorescencia

Para evaluar la localización mitocondrial, las células cultivadas en cubreobjetos se lavaron con PBS frío y se fijaron con paraformaldehído 4% durante 15 minutos. Luego, las células se permeabilizaron con Triton X-100 0,5% durante 20 min y se bloquearon con suero de cabra 5% durante 30 min. Las células se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C y con anticuerpos secundarios durante 1 h. Después de lavar tres veces, las células se tiñeron con 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y se tomaron imágenes con un microscopio de barrido láser confocal.

Medición de ATP

Además, la concentración de ATP intracelular se midió utilizando un kit de ensayo de ATP siguiendo el protocolo del fabricante. Las células se lisaron en el tampón de lisis mediante pipeteo repetido y se centrifugaron a 4 °C y 13.000 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes se utilizaron para el análisis de los niveles de ATP y las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el ensayo BCA. Se añadió un volumen de cincuenta microlitros de sobrenadante a 100 µl de solución de detección de ATP, se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, se mezcló inmediatamente y se determinó la luminiscencia utilizando un luminómetro (Flex Station 3). La concentración de ATP se calculó según una curva estándar y se convirtió en nmol/μg de proteína.

transferencia Western

La expresión de proteínas se evaluó mediante transferencia Western y se cuantificó con densitometría. Las células H9c2 tratadas con Dox y Dox + Brev en placas de cultivo celular de 10 cm se lisaron con el tampón de lisis RIPA. Tomando 5 mg de tejido y añadiendo 10 ml de tampón de lisis. Se utilizó el método Bradford para medir la concentración de proteína, utilizando BSA como estándar. Se mezclaron cantidades equivalentes de proteínas con tampón de carga (5X) y se hirvieron a 95°C durante 5 min. Luego, las proteínas se resolvieron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida SDS 10%-12% (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de PVDF. Después de bloquear con leche 5% en TBST durante 2 h a temperatura ambiente, las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos específicos, como GAPDH policlonal de conejo. El análisis WB de la expresión y fosforilación de proteínas se realizó utilizando anticuerpos contra AMPK, Parkin, PINK1, Akt, PI3K, Tom20 y GAPDH como control interno. Las señales específicas se visualizaron utilizando el sistema Bio-Rad gel doc (Bio-Rad Laboratories, California, Estados Unidos). Los datos se presentan como la media ± DE (norte = 3) y cuantificado mediante análisis ImageJ.

La cría de animales

En los experimentos se utilizaron ratones hembra C57BL/6 de ocho semanas de edad (SiPeiFu, Beijing, China). Los animales se alojaron en jaulas y en un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad a 50% de humedad y 25°C ± 2°C. Los animales tuvieron libre acceso a una dieta estándar en pellets y agua. El plasma se obtuvo por centrifugación a 200 g durante 10 minutos a 4 °C y se mantuvo a -80 °C antes de la extracción.

La investigación se ajusta a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicado por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (Publicación NIH No. 85–23, revisada en 1985).

Protocolos de experimentación con animales.

Los ratones fueron asignados aleatoriamente a seis grupos de tratamiento, incluido un grupo de control, un grupo modelo (grupo Dox), grupos de tres dosis de Dox + Brev y un grupo de Dox + Dexra.

Para imitar los regímenes terapéuticos humanos, se administró una dosis acumulativa de 12 mg/kg de Dox. a través de tres inyecciones ip semanales (4 mg/kg los días 0, 7 y 14) excepto para el grupo de control.

Para investigar el efecto de Brev en vivo, los ratones fueron tratados con Brev, seguido de una inyección ip diaria de 4,8 y 16 mg/kg de Brev durante 3 semanas, y los ratones en el grupo de tratamiento con Dox + Dexra recibieron 12 mg/kg de Dexra mediante inyección intraperitoneal durante 3 semanas además de Dox. tratamiento. (). Brev y Dexra fueron tratados después de las inyecciones de Dox. La supervivencia se controló diariamente y la función cardíaca se evaluó mediante ecocardiografía, 3 semanas después de la primera inyección de Dox ().

Al grupo de control se le inyectó el mismo volumen de solución salina normal. Los ratones fueron sacrificados 1 semana después de la administración de Dox.

Estudios de tumores

A los ratones se les inyectó por vía subcutánea 1×105 Células tumorales de mama 4T1. Una semana después de la inyección de células, cuando el diámetro medio de los tumores era superior a 2 mm, los ratones fueron tratados con Dox o breviscapina como se describió anteriormente. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana durante un máximo de 4 semanas y los volúmenes del tumor se calcularon con la siguiente ecuación: V = 4π/3×(L/2)2× (W/2), donde V, L y W representan el volumen, longitud y ancho del tumor, respectivamente.

18Imágenes PET/CT con F-fluorodesoxiglucosa

Se anestesiaron ratones del grupo Dox y breviscapina (en ayunas durante la noche) con isoflurano 2% y se les inyectó aproximadamente 11 MBq/0,2 ml de PET con fluorodesoxiglucosa (FDG). a través de una vena de la cola y luego regresaron a sus jaulas. Cuarenta minutos más tarde, los ratones fueron anestesiados nuevamente con isoflurano 2% y colocados en una cama estereotáxica en un microPET Focus 220 (Siemens Company, Berlín, Alemania). Luego se inició una exploración PET estática de 20 minutos. Posteriormente, se tomaron imágenes de los ratones en un microCAT II (Siemens Company, Berlín, Alemania) con una intensidad del haz de rayos X de 180 mA y un voltaje del tubo de rayos X de 80 kVp para el registro conjunto anatómico con las imágenes PET.

Pacientes

Tras más de 4 h de ayuno y controlando que la glucemia fuera inferior a 120 mg/dl, todos los pacientes recibieron una administración intravenosa de 18F-FDG (5,5 MBq/kg). Las exploraciones PET/CT se iniciaron 60 minutos después de la inyección utilizando una biografía combinada PET/CT (Siemens Company, Berlín, Alemania). Todas las exploraciones se realizaron en un modelo tridimensional. Primero se obtuvo una tomografía computarizada de dosis baja para corrección de atenuación y correlación anatómica. La autorización ética se ajusta a la Guía para el documento de aprobación del comité de ética publicada por el Hospital Afiliado de la Universidad de Qingdao (QDU-HEC-2022057).

Análisis de la función cardíaca e histopatología.

El tejido cardíaco de ratón de cada grupo se almacenó en paraformaldehído 4%, se embebió en cera de parafina y se cortó en serie en secciones de 4 mm. Se desparafinaron secciones de tejido. a través de inmersión en xileno (3 veces, durante 5 min cada una) y rehidratación utilizando una serie descendente de alcoholes (alcohol 100%, 90%, 85% y 75%, 5 min cada uno). Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina para análisis histológico. Las muestras de biopsia se tiñeron con tinción tricrómica de Masson para investigar cualquier cambio morfológico y fibrótico en el corazón. La tinción azul representó acumulación de colágeno. La inmunohistoquímica se realizó utilizando los kits de tinción Histone Simple (Nichirei, Tokio, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se trataron durante 15 minutos con 3% H2O2 en metanol para inactivar las peroxidasas endógenas y luego se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con los anticuerpos primarios IL-1, 1:100. Luego se observó la ultraestructura con un aumento de 20X utilizando un microscopio de fluorescencia invertida CMS GmbH de Leica Microsystems (Leica Camera AG, Barnack, Alemania).

Medición de los niveles de glucosa.

Los ratones se mantuvieron con una dieta normal. El día de la experimentación, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 h (comenzando a las 8 am) y se extrajo sangre. a través de la vena de la cola para la medición de los niveles de glucosa.

Se lavaron células de cardiomioblastos de rata H9c2 con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se centrifugaron y se trituraron ultrasónicamente, y se incubaron en condiciones estándar de cultivo celular durante 10 minutos. Después de la incubación, se midió la absorbancia utilizando un lector de microplacas (Perkin Elmer, Massachusetts, Estados Unidos).

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Los tejidos de ratón se lisaron con el tampón de lisis. Las muestras se sonicaron con un homogeneizador Qsonica usando pulsos de 30 Hz durante 20 segundos y luego se centrifugaron a 12.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió, se distribuyó en alícuotas en viales de 200 µl y se almacenó a -80 °C. Las concentraciones de proteínas de las muestras se cuantificaron mediante el ensayo BCA. Las muestras se analizaron utilizando kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para TNF-α, IL-1β e IL-6 según el protocolo del fabricante. La densidad óptica se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas VICTOR Nivo™ (Perkin Elmer, Massachusetts, Estados Unidos).

Determinación de cambios en el metaboloma del ratón.

Las muestras de sangre se resuspendieron, se incubaron en hielo, se centrifugaron, se diluyeron hasta la concentración final y se centrifugaron. Finalmente, el sobrenadante se inyectó en el sistema LC-MS/MS para su análisis. Los análisis UHPLC-MS/MS se realizaron utilizando un sistema Vanquish UHPLC (Thermo Fisher, Massachusetts, Estados Unidos) junto con un Orbitrap Q Exactive.MT Espectrómetro de masas HF (Thermo Fisher, Massachusetts, Estados Unidos). Los metabolitos identificados se anotaron utilizando la base de datos KEGG, la base de datos HMDB y la base de datos LIPID Maps. El análisis de componentes principales (PCA) y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parcial (PLS-DA) se realizaron utilizando metaX. Se aplicó análisis univariado (t-prueba) para calcular la significación estadística (pag-valor). Metabolitos con un VIP>1, pag un valor <0,05 y un cambio en veces ≥2 o ≤0,5 se consideraron metabolitos diferencialmente abundantes.

análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA con IBM SPSS Statistics (V19.0, América). Los datos se presentan como la media ± DE (norte = 6–9). pag < 0,05 se consideró significativo.

Resultados

Las antraciclinas reducen el metabolismo de la glucosa en el miocardio y aumentan la utilización de ácidos grasos.

primero estudiamos 18Las imágenes PET/CT con F-FDG de los corazones de pacientes tratados con quimioterapia con antraciclina y pacientes sin quimioterapia, y el análisis de datos mostraron (Figura 1A) una tendencia hacia una reducción de la captación de glucosa en el miocardio en pacientes tratados con quimioterapia. Predijimos que los cambios en este parámetro pueden estar correlacionados con la cardiotoxicidad inducida por antraciclina. Para verificar el vínculo intrínseco entre las anomalías metabólicas y la CID, establecimos un modelo de ratón con CID inducida por Dox, y el 18Los resultados de la PET con F-FDG mostraron que la captación cardíaca fue significativamente menor en los ratones tratados con Dox que en los ratones no tratados después de 4 semanas (Figura 1B). Esto sugiere que las antraciclinas afectan el metabolismo de la glucosa miocárdica tanto en pacientes como en modelos de ratón.

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(A) Concentración de 18F-FDG captada por el corazón de pacientes tratados con quimioterapia y sin quimioterapia. (B) 18Adquisición de imágenes F-FDG PET/CT y 18Captación de F-FDG. (C) Mapa de calor de ratones tratados con Dox. (D) Contenido de MDA en células H9c2. (MI) Tinción HE que muestra que Dox redujo el tamaño de los cardiomiocitos. Control vs. Dox: ***pag < 0,0005, **pag < 0,005, *pag < 0,05, media ± DE. norte = 6–9.

En condiciones normales, el miocardio utiliza principalmente azúcares y lípidos para el suministro de energía; los azúcares y los lípidos representan aproximadamente 20%-30% y 60% de energía miocárdica, respectivamente; Además, la glucosa es más eficiente en la producción de ATP (). No está claro cómo se adapta el corazón a la remodelación del metabolismo energético en el miocardio mediante intervenciones quimioterapéuticas y si tales alteraciones afectan la homeostasis cardíaca y conducen al desarrollo de CID. Al analizar datos metabolómicos de ratones (Figura 1C), encontramos que los metabolitos que mostraron niveles aumentados después de la exposición a Dox estaban involucrados principalmente en la clasificación de lípidos y que la disminución en los niveles de indicadores del metabolismo de la glucosa como D-glucosa-6-fosfato y AKG era obvia. Además, el análisis de enriquecimiento de KEGG mostró que las vías metabólicas de los lípidos se alteraron significativamente después de la exposición a Dox (Figura complementaria S1). El nivel del metabolito de la FAO MDA en el miocardio (Figura 1D) se elevó significativamente después del tratamiento con Dox. Esto sugiere que el metabolismo de la glucosa en el corazón se altera después de la intervención de Dox y es reemplazado por una mayor quema de lípidos, que es relativamente menos eficiente desde el punto de vista energético. Este metabolismo lipídico inadecuado provoca la acumulación de una gran cantidad de lípidos en el miocardio, y la tinción patológica reveló una gran cantidad de vacuolas lipídicas en los corazones de los animales expuestos a Dox, lo que lleva a la esteatosis cardíaca (Figura 1E).

Las antraciclinas aumentan el consumo de oxígeno del miocardio y disminuyen la tasa de producción de ATP.

Curiosamente, esta compensación metabólica aumentó los niveles de ROS en el miocardio, lo que llevó a un mayor estrés oxidativo.Figura 2A). El análisis del metabolismo energético de O2K mostró que Dox aumentó el consumo de oxígeno del miocardio (Figura 2B) y condujo a la hiperpolarización de la membrana mitocondrial (Figura 2C) (esto también es un signo de niveles elevados de estrés oxidativo mitocondrial y se observa a menudo en modelos de isquemia-reperfusión cardíaca). La tinción con JC-1 también mostró que la exposición a Dox provocó un aumento en el potencial de membrana (intensidad de fluorescencia roja mejorada) en algunas células supervivientes (Figura 2D). Aunque en el corazón se produjeron procesos compensatorios como el aumento del consumo de oxígeno y la oxidación de lípidos, desafortunadamente la tasa de producción de ATP en el miocardio se redujo drásticamente en respuesta a la reducción del metabolismo de la glucosa.Figura 2E). La comparación de la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de producción de ATP mostró que la exposición a Dox condujo al consumo de una gran cantidad de oxígeno por parte del miocardio pero a la producción de solo una pequeña cantidad de ATP (Figura 2F), aumentando considerablemente la carga sobre el corazón. Este déficit en la producción de energía provocó un aumento significativo en el nivel del receptor de energía AMPK en el grupo Dox (Figura 2G). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el corazón exhibe una alta tasa de consumo de oxígeno y una baja tasa de producción de ATP en respuesta al deterioro del metabolismo de la glucosa causado por las antraciclinas y que este fenómeno no satisface completamente los requisitos energéticos del miocardio pero conduce a un estrés oxidativo excesivo. Por lo tanto, se especula que en respuesta a la brecha energética, la oxidación de lípidos en el corazón aumenta y se acumula más ROS, y esta vía de retroalimentación deficiente puede ser un factor importante de la CID.

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(A) Intensidad de la tinción con ROS en células H9c2. (B) Consumo de oxígeno cardíaco en células H9c2. (C) El potencial de membrana mitocondrial. (D) Tinción JC-1 y gráfico de barras. (MI) Contenido de ATP en células H9c2. (F) La relación producción de ATP/consumo de oxígeno en células H9c2. (GRAMO) Se midieron los niveles de expresión de AMPK y β-tubulina. in vitro por el Banco Mundial. Control vs. Dox: ***pag < 0,0005, **pag < 0,005, *pag < 0,05, media ± DE. norte = 6–9.

El nuevo agente cardioprotector breviscapina promueve el metabolismo de la glucosa cardíaca e inhibe la miocardiopatía inducida por Dox

Inspirándonos en los resultados antes mencionados, investigamos el efecto protector del flavonoide breviscapina, utilizado para tratar enfermedades cardiovasculares, contra la progresión de la CID desde una perspectiva metabólica. El protocolo experimental se muestra en Figura 3A, y 18Las imágenes PET/CT con F-FDG se realizaron en ratones 1 semana después de la primera inyección de doxorrubicina. Como se muestra en Figura 3B, la captación cardíaca fue significativamente mayor en el grupo tratado con breviscapina que en el grupo tratado con Dox solo, lo que sugiere que la intervención con breviscapina podría revertir la disminución inducida por Dox en el metabolismo de la glucosa cardíaca y remodelar el metabolismo energético cardíaco. A continuación se examinaron la función cardíaca y los cambios patológicos después del tratamiento con breviscapina y se utilizó el fármaco clínico dexrazoxano (Dexra) como control positivo. La ecocardiografía en Figura 3C mostró que LVEF y LVFS en el grupo Dox fueron significativamente más bajos que aquellos en el grupo de control, y LVESV y LVD fueron significativamente más altos que aquellos en el grupo de control. Estos resultados sugieren que la función sistólica del ventrículo izquierdo de los ratones disminuyó después del tratamiento con Dox, y que la lesión miocárdica inducida por Dox en este estudio fue similar a la miocardiopatía dilatada. Dox redujo la función sistólica, que es similar a lo que se ha informado anteriormente (). Todas las funciones se restauraron en los corazones de los animales tratados con Brev y Dox en comparación con los de los animales tratados sólo con doxorrubicina. La cTnI es un biomarcador de lesión miocárdica (). La concentración de cTnI aumentó significativamente en los ratones tratados con doxorrubicina sola en comparación con los del grupo control, y diferentes concentraciones de Brev mostraron mejores efectos (Figura 3D). Además, la tinción de tejidos cardíacos patológicos después de diferentes tratamientos mostró que la estructura del tejido cardíaco en ratones del grupo de control era normal. A diferencia de los del grupo de control, los ratones del grupo Dox exhibieron una gran cantidad de lesiones cardíacas, incluyendo necrosis, edema intracelular, trastorno y rotura miofibrilar y degeneración ondulada de las fibras cardíacas. Curiosamente, el preacondicionamiento con breviscapina previno este tipo de lesión, alivió la acumulación excesiva de lípidos cardíacos y restableció la homeostasis miocárdica.Figura 3F). La tinción de Masson del miocardio mostró que la fibrosis intersticial aumentó significativamente después del tratamiento con Dox y que la intervención de Brev redujo el grado de fibrosis cardíaca (Figura 3E). Los datos de la ecografía cardíaca mostraron que LVESV y LVID fueron significativamente mayores en el grupo de Dox que en el grupo de control, lo que sugiere un agrandamiento del diámetro de la cavidad ventricular y que el tratamiento con breviscapina podría aliviar significativamente estos cambios. Estos resultados sugieren que la breviscapina puede remodelar el metabolismo cardíaco, aumentar la captación de glucosa cardíaca, reducir la esteatosis cardíaca y aliviar la disfunción cardíaca inducida por la doxorrubicina y los cambios en la morfología del miocardio.

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(A) Protocolo esquemático para tratamientos con ratones. (B) 18Las imágenes PET/CT con F-FDG se realizaron en ratones 1 semana después de la primera exposición a Dox y la concentración de 18F-FDG absorbida por el corazón. (C) Los ecocardiogramas mostraron que la breviscapina previno la dilatación del ventrículo izquierdo inducida por Dox. Ecocardiogramas representativos de eje corto en modo M que muestran que Dox indujo la dilatación del ventrículo izquierdo y que la breviscapina ejerció efectos protegidos en el grupo de Dox + Brev. La FE y la FS en diástole fueron significativamente menores en los ratones tratados con breviscapina que en los tratados con Dox, y la FC fue significativamente mayor. (D) La breviscapina redujo la concentración de cTnI. (MI) Tinción de Masson que muestra que la breviscapina redujo el grado de fibrosis cardíaca inducida por Dox. (F) Tinción HE que muestra que la breviscapina protege contra la reducción del tamaño de los cardiomiocitos inducida por Dox en el corazón. Control frente a Dox, 4 mg/kg, 8 mg/kg o 16 mg/kg Brev frente a Dox y Dexra frente a Dox: ***pag < 0,0005, **pag < 0,005, *pag < 0,05, media ± DE. norte = 6–9.

La breviscapina remodela el metabolismo cardíaco de la glucosa y los lípidos mediante la regulación de los niveles séricos periféricos y la expresión de AKT en el miocardio.

A continuación, estudiamos cómo la breviscapina regula el equilibrio del metabolismo del azúcar y las grasas. Como se muestra en Figura 4E, el nivel de serotonina en el suero periférico en ratones tratados con breviscapina aumentó dramáticamente en comparación con el de los ratones tratados con Dox, y el grado de disminución mostró una relación lineal con la dosis de breviscapina, siendo una disminución de más de 95%. observado en el grupo de dosis alta. La serotonina (5-HT) es una monoamina que tiene una variedad de funciones en los sistemas neuronales y no neuronales (). En el sistema nervioso central, la 5-HT actúa como un neurotransmisor que regula el estado de ánimo y la conducta alimentaria.). Estudios recientes han demostrado que la 5-HT periférica desempeña un papel importante en la regulación metabólica de los tejidos periféricos al inhibir la termogénesis adaptativa en el tejido adiposo marrón. La inhibición de la síntesis de 5-HT reduce el aumento de peso y mejora la disfunción metabólica en un modelo de ratón con obesidad inducida por la dieta (). Los estudios de asociación de todo el genoma también han revelado un vínculo genético entre el sistema serotoninérgico y la obesidad. La serotonina tiene dos efectos diferentes sobre el metabolismo de la glucosa: induce directamente la secreción de insulina en las células B pancreáticas, lo que reduce los niveles de glucosa en sangre; e inhibe la absorción de glucosa de la sangre por tejidos distintos del hígado y el músculo esquelético, elevando los niveles de azúcar en sangre (). Los estudios han demostrado que el tratamiento con serotonina puede provocar un aumento repentino y grande de los niveles de glucosa en sangre, pero aún no está claro cómo la serotonina inhibe la absorción tisular de glucosa de la sangre. Nuestros resultados experimentales mostraron que después del tratamiento con breviscapina, los niveles periféricos de serotonina disminuyeron drásticamente, lo que corresponde a un aumento en la ingesta cardíaca de glucosa (Figura 4E), mientras que la ingesta de glucosa en el hígado no cambió significativamente (Figura complementaria S2) y los niveles de glucosa en ayunas (FBG) disminuyeron (Figura 4A). En el grupo de breviscapina, la suplementación adicional con 5-HT aumentó el nivel de serotonina en ratones y disminuyó la captación cardíaca de glucosa (Figura 4B). Para analizar más a fondo cómo la serotonina regula el metabolismo de los cardiomiocitos, agregamos 5-HT adicional para aumentar los niveles de serotonina en ratones modelo de lesión miocárdica inducida por Dox y luego recolectamos los corazones de los ratones para el análisis del transcriptoma. Los resultados mostraron que la oxidación de los ácidos grasos en el grupo tratado con Dox y 5-HT fue significativamente mayor que en el grupo de Dox solo (Figura complementaria S3). Luego analizamos los cambios en la vía PI3K-proteína quinasa B (Akt/PKB), un importante regulador del metabolismo de la glucosa miocárdica que desempeña un papel importante en la regulación de la absorción de glucosa; promover la división, proliferación y supervivencia celular; e inhibir la apoptosis. Los resultados mostraron que la adición de 5-HT inhibió directamente la expresión génica de Akt pero no cambió significativamente la subunidad catalítica PI3K ni el nivel de la subunidad reguladora (Figura 4C). La pérdida de AKT reduce la capacidad de los cardiomiocitos para metabolizar la glucosa. Estos resultados sugieren que la breviscapina alivia el efecto inhibidor de la serotonina sobre la captación de glucosa en los tejidos al reducir significativamente el nivel de serotonina y asegura la absorción de glucosa de la sangre en condiciones patológicas, revelando la posibilidad de que el cuerpo pueda participar en la regulación del metabolismo cardíaco. remodelación a través de neurotransmisores. Más importante aún, la breviscapina, como fármaco cardiovascular de uso común en China, puede reducir los niveles periféricos de serotonina en más de 90% y tiene un efecto más potente que el clásico inhibidor de la recaptación de serotonina fluoxetina en el tratamiento de la hipertrofia miocárdica y la insuficiencia cardíaca inducida por el metabolismo de la glucosa miocárdica. trastorno y diabetes, lo que representa un nuevo agente seguro para el tratamiento de la cardiotoxicidad inducida por Dox. Los estudios epidemiológicos también han demostrado que la diabetes aumenta el riesgo de cardiotoxicidad inducida por Dox; por lo tanto, este estudio proporciona una posible estrategia de tratamiento para pacientes con diabetes y cáncer ().

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(A) Niveles de glucosa en sangre en ayunas en ratones. (B) Concentración de 18F-FDG captada por el corazón después de la suplementación con 5-HT. (C) El mapa de calor del análisis del transcriptoma después de la suplementación con 5-HT. (D) Se midieron los niveles de expresión de PI3K, Akt y GAPDH. in vitro por el Banco Mundial. (MI) El nivel de serotonina en el suero periférico en ratones. (F) El nivel de D-glucosa 6-fosfato en ratones. (GRAMO) El nivel de ácido α-cetoglutárico en ratones. Control frente a Dox, 4 mg/kg, 8 mg/kg o 16 mg/kg Brev frente a Dox y Brev+5-HT frente a Brev: ***pag < 0,0005, **pag < 0,005, *pag < 0,05, media ± DE. norte = 6–9.

Con base en estos hallazgos, investigamos cómo la breviscapina regula la glucosa. Utilización por el corazón. Los resultados mostraron que la expresión de la proteína PI3K en ratones expuestos a Dox disminuyó significativamente y que el nivel de expresión de la proteína PI3K en el tejido cardíaco aumentó significativamente después de la intervención con breviscapina. Curiosamente, la expresión de AKT se mantuvo en niveles bajos tanto en el grupo control como en el grupo expuesto a Dox, y se observó un aumento significativo de la expresión de AKT después del tratamiento con breviscapina (Figura 4D). Estudios anteriores han demostrado que AKT estimula el metabolismo de la glucosa en las células, convirtiendo la glucosa en D-glucosa 6-fosfato a través de hexoquinasa para la glucólisis o polimerización a glucógeno. Nuestros resultados mostraron que después de que la breviscapina promoviera la expresión de AKT miocárdico, los niveles de D-glucosa 6-fosfato y ácido α-cetoglutárico relacionados con el metabolismo de la glucosa aumentaron significativamente (Figura 4F, G), lo que sugiere que la breviscapina mejoró la capacidad del miocardio para utilizar la glucosa como fuente de energía a través de AKT y promovió el catabolismo de la glucosa. Estudios anteriores han informado que el aumento de la expresión de PI3K-Akt puede promover la utilización del azúcar en los tejidos periféricos, reducir la resistencia a la insulina, mejorar el suministro de energía cardíaca y prevenir la insuficiencia cardíaca, mientras que la inhibición de la vía PI3K-Akt afecta las actividades fisiológicas de las células cardíacas (). Estos resultados sugieren que la breviscapina mejora la resistencia a la lesión miocárdica inducida por Dox al modular la activación de la vía PI3K-Akt. Estos resultados sugieren que la breviscapina regula los niveles de glucosa en sangre mediante la inhibición de la serotonina, bloquea la restricción de la utilización de la glucosa en el miocardio y promueve el metabolismo de la glucosa en el miocardio mediante la activación de la vía PI3K-Akt. Por lo tanto, la serotonina puede ser un objetivo importante para regular el metabolismo de los glicolípidos cardíacos. Luego analizamos los cambios en la función cardíaca y la homeostasis después de la remodelación del metabolismo de los glicolípidos del miocardio. En comparación con el grupo del modelo Dox, la producción miocárdica de ATP en el grupo tratado con breviscapina aumentó significativamente (Figura 5A), mientras que los niveles de ROS y MDA, un metabolito de la FAO, disminuyeron significativamente (Figuras 5B,E). El análisis del metabolismo energético O2K mostró que la breviscapina inhibió el dramático aumento en el consumo cardíaco de oxígeno causado por la exposición a Dox (Figura 5C), disminuyó significativamente la relación producción de ATP/consumo de oxígeno (Figura 5D), y normalizó el potencial de membrana mitocondrial (Figura complementaria S4). Esto sugiere que el tratamiento con breviscapina aumenta la capacidad del miocardio para utilizar glucosa de alta eficiencia energética como fuente de energía; mejora la eficiencia de la producción de ATP; y reduce la carga cardíaca, el estrés oxidativo y el consumo de oxígeno del miocardio. En conclusión, la breviscapina puede romper eficazmente el círculo vicioso de una alta tasa de consumo de oxígeno y una combustión inadecuada de lípidos en el corazón causada por la exposición a Dox al regular el circuito serotonina-glucemia-AKT miocárdico, remodelar el metabolismo energético del miocardio, aumentar la utilización de glucosa y reducir la FAO. (Figura 5F), impidiendo el desarrollo posterior de CID.

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(A) Contenido de ATP en células H9c2. (B) Contenido de MDA en células H9c2. (C) Consumo de oxígeno cardíaco en células H9c2. (D) La relación producción de ATP/consumo de oxígeno en células H9c2. (MI) La intensidad de la tinción con ROS en células H9c2. (F) Diagrama esquemático. Control frente a Dox, Brev frente a Dox y Dexra frente a Dox: ***pag < 0,0005, **pag < 0,005, *pag < 0,05, media ± DE. norte = 6–9.

Breviscapina elimina el daño mitocondrial y restaura la homeostasis miocárdica después del tratamiento con Dox a través de la vía de señalización PINK1/Parkin

Aunque las hipótesis sobre los mecanismos de la CID han variado en las últimas décadas, las características clave de la CID son el desequilibrio redox y el deterioro de la función mitocondrial. Los resultados impidieron mejorar previamente la hipótesis del desarrollo de CID desde la perspectiva de la relación de energía cardíaca y la eficiencia de la producción de energía, pero plantean una pregunta clave, a saber, cómo la breviscapina logra una producción de energía eficiente y la homeostasis microambiental cardíaca optimizando la red metabólica en el corazón después de la mitocondria. lesión. Por lo tanto, nuestro objetivo era responder a esta pregunta. La supuesta vía de señalización PINK1/Parkin inducida por Pten es una de las principales vías mediadas por la autofagia mitocondrial y desempeña un papel importante en el mantenimiento del metabolismo energético de los cardiomiocitos.). Cuando las mitocondrias de las células del miocardio se dañan, PINK1, como "centinela" del sistema de control de calidad mitocondrial, se acumula en la membrana externa de las mitocondrias y recolecta y fosforila Parkin (). El Parkin activado ubiquitina las mitocondrias dañadas, que luego se fusionan con los lisosomas para completar la degradación. La autofagia mitocondrial mejorada mediada por la vía de señalización PINK1/Parkin puede mantener la homeostasis mitocondrial en los cardiomiocitos y retardar la progresión de la enfermedad cardíaca.).

Por lo tanto, especulamos que la breviscapina mejora la autofagia mitocondrial a través de la vía PINK1/Parkin y mantiene la homeostasis mitocondrial en los cardiomiocitos. WB demostró que, en comparación con el grupo de Dox, el nivel de expresión de la proteína total de PINK1/Parkin en el grupo de tratamiento con breviscapina aumentó significativamente (Figura 6A), y el nivel de fosforilación correspondiente también aumentó significativamente (Figura 6B). En el grupo de tratamiento con Dox, la expresión de la proteína PINK1/Parkin mostró una tendencia decreciente y la fosforilación de proteínas disminuyó significativamente, mientras que el nivel de la proteína de la membrana mitocondrial Tom20 aumentó, lo que sugiere que aunque Dox indujo daño mitocondrial, inhibió la eliminación oportuna de las células dañadas. mitocondrias. Se observó una gran cantidad de mitocondrias rotas y dañadas en el grupo Dox (flecha roja, Figura 6D), mientras que en el grupo Brev se observó una gran cantidad de autofagia mitocondrial envuelta en lisosomas (flecha azul). Cuando se aplicaron Dox y Brev simultáneamente, la cresta mitocondrial era obvia, la morfología mitocondrial era normal y la estructura de la membrana estaba intacta. Al teñir con MitoTracker, la intensidad de fluorescencia más alta se encontró en el grupo Dox (Figura 6C), lo que indica que había significativamente más mitocondrias en el grupo Dox que en los grupos control y Brev. Además, los niveles de las proteínas antioxidantes NADH y SOD aumentaron significativamente después del tratamiento con Brev (Figura complementaria S5). La fosforilación del receptor de energía AMPK se redujo significativamente en el grupo de tratamiento con Brev en comparación con el grupo de Dox, mientras que los centros de control del crecimiento celular se activaron (Figura 6E). Estos resultados indican que la exposición a Dox causa daño miocárdico, acumulación mitocondrial y desequilibrio de la homeostasis, lo que hasta cierto punto explica por qué la eficiencia de la producción de energía cardíaca se reduce y el estrés oxidativo aumenta después de la administración de Dox. La breviscapina puede promover la autofagia mitocondrial, eliminar las mitocondrias dañadas y restaurar la homeostasis miocárdica, asegurando eficazmente el equilibrio dinámico entre la producción cardíaca de ATP y el estrés oxidativo.

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(A) Se midieron los niveles de expresión de PINK1, Parkin, Tom20 y GAPDH. in vitro por el Banco Mundial. (B) Se evaluaron los niveles de expresión de p-PINK1, p-Parkin y Tom20. (C) Tinción con mitotrazadores. (D) Microscopio de electrones. (MI) Se evaluaron los niveles de expresión de p-AMPK, p-mTOR, p-Akt y p-PI3K. (F) La intensidad de la tinción con ROS en células H9c2 después de la suplementación con Mdivi-1. (GRAMO) Contenido de ATP en células H9c2 después de la suplementación con Mdivi-1.(H) Gráfico de barras de p-AMPK/t-AMPK, p-mTOR/t-mTOR, p-Akt/t-Akt y p-PI3K/t-PI3K. Control frente a Dox, Dox + Mdivi-1 frente a Dox y Dox + Brev + Mdivi-1 frente a Dox + Brev: ***pag < 0,0005, **pag < 0,005, *pag < 0,05, media ± DE. norte = 6–9.

Cuando Mdivi-1 bloqueó este efecto de la breviscapina, el nivel de ROS en los cardiomiocitos aumentó significativamente (Figura 6F), mientras que la producción de ATP disminuyó significativamente (Figura 6G). Además, la tasa de supervivencia de los cardiomiocitos disminuyó (Figura complementaria S6), y se inhibió el efecto reparador de la breviscapina sobre los cardiomiocitos. Cuando se combinaron Dox y Mdivi-1, la producción de ATP y la tasa de supervivencia de las células del miocardio se redujeron aún más, el nivel de ROS aumentó y la lesión del miocardio se agravó. Estos resultados sugieren que la autofagia mitocondrial juega un papel clave en la lesión de los cardiomiocitos inducida por Dox. La remodelación de la red metabólica del corazón por sí sola no puede compensar completamente la disfunción causada por la lesión mitocondrial, y el efecto protector miocárdico de la breviscapina depende de la regulación del metabolismo de la glucosa y los lípidos y de la activación de la autofagia mitocondrial. Esta también puede ser la razón por la cual no se ha considerado la regulación de la red metabólica cardíaca con respecto a la hipótesis del desarrollo de CID. Se sugiere que prevenir la progresión de la enfermedad y restaurar la función cardíaca debería ser igualmente importante en el tratamiento de los síntomas de disfunción e insuficiencia cardíaca causadas por Dox, lo que es más beneficioso para el pronóstico y la calidad de vida de los pacientes.

La breviscapina tiene sinergia con la quimioterapia contra el cáncer de mama al aliviar la inflamación y reducir la infiltración de células inmunosupresoras después de la administración de Dox.

Según la teoría del origen mitocondrial, las mitocondrias se derivan de la fusión de bacterias aeróbicas, lo que significa que las mitocondrias tienen propiedades extrañas (). Cuando las mitocondrias están dañadas, se desencadenan patrones moleculares asociados al daño (DAMP), que activan la respuesta inmune del cuerpo (). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la breviscapina promueve la eliminación de las mitocondrias dañadas y ayuda a reducir la inflamación. Los resultados mostraron que los niveles séricos de las citocinas inflamatorias interleucina-1β (IL-1β), IL-6 y factor de necrosis tumoral α (TNF-α) disminuyeron significativamente después de la intervención con breviscapina (Figura 7A), y la inmunotinción de tejidos cardíacos mostró que IL-1β se expresaba en niveles bajos (Figura complementaria S7). Estos resultados sugieren que la breviscapina puede reducir la secreción de factores inflamatorios y reducir la respuesta inflamatoria en ratones expuestos a Dox. Los factores reguladores inflamatorios y las células efectoras son componentes importantes del microambiente tumoral y desempeñan un papel importante en la relación entre la inflamación y los tumores.). La inflamación en el microambiente tumoral tiene una variedad de efectos protumorales, que pueden promover la proliferación y supervivencia de células malignas, angiogénesis y metástasis; debilitar la respuesta inmune adquirida del cuerpo; y cambiar la respuesta del cuerpo a las hormonas y los medicamentos de quimioterapia (). La breviscapina redujo la inflamación después del tratamiento con Dox, pero no afectó el efecto letal de Dox sobre las células de cáncer de mama. in vitro (Figura 7B). Aún no está claro si puede ayudar a prevenir la migración de células inflamatorias al foco tumoral, especialmente en el tratamiento cooperativo de macrófagos asociados a tumores (TAM). Los TAM son importantes células inmunes infiltrantes y pueden representar 50% de células tumorales en el cáncer de mama. Los TAM y las células relacionadas en tumores de ratón y humanos suelen ser macrófagos M2, que han promovido el crecimiento tumoral y la angiogénesis, mejorado la resistencia al tratamiento e inhibido la inmunidad adquirida.). Reducir la infiltración de TAM o la eliminación de TAM inducida por fármacos es una estrategia emergente para la inmunoterapia tumoral. Por lo tanto, construimos un modelo de ratón con cáncer de mama 4T1 (Figura 7C). Ratones con tumores 4T1 en el lugar (200 milímetros3) se dividieron aleatoriamente en 3 grupos (norte = 5) y se inyecta con solución salina tamponada con fosfato (PBS), Dox o Dox + Brev. Dox y Brev se administraron en dosis de 10 mgkg−1 peso corporal y 1,4 mgkg−1 peso corporal, respectivamente. Los ratones se sacrificaron 7 días después del tratamiento y los tumores se recogieron para FCM y evaluación histológica. Después del tratamiento con Dox + Brev, se redujo la proporción de macrófagos asociados a tumores (TAM) que se infiltraban en el tumor (Figura 7D). La tinción histológica del tejido tumoral mostró una expresión significativamente menor del marcador fenotípico M2 CD206 (Figura 7E). El volumen del tumor en ratones tratados con Dox + Brev fue significativamente menor que el de los ratones tratados con Dox solo (Figura 7F), lo que sugiere que la breviscapina puede inhibir el crecimiento tumoral al reducir la inflamación y la infiltración de TAM.

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(A) Niveles séricos de las citocinas inflamatorias IL-1β, IL-6 y TNF-α. (B) Viabilidad de las células MCF-7 in vitro(C) Protocolo esquemático del tratamiento de ratones con tumores. (D) Se recogieron tumores de ratón para FCM. (MI) Tinción histológica de tumores para el marcador fenotípico M2 CD206. (F) El promedio de la carga tumoral total. *pag < 0,0005. Control frente a Dox, Dexra frente a Dox y Brev frente a Dox: ***pag < 0,0005, **pag < 0,005, *pag < 0,05, media ± DE. norte = 6–9.

 

Discusión

Este estudio revela que la disfunción del metabolismo de la glucosa y los lípidos es una fuerza impulsora importante de la cardiotoxicidad inducida por antraciclina y que restaurar el metabolismo cardíaco, promover el metabolismo de la glucosa miocárdica y mejorar la eficiencia de la producción de energía del miocardio son métodos eficaces para prevenir los efectos secundarios cardíacos de Dox. Pueden promover la autofagia mitocondrial, la eliminación de mitocondrias dañadas. La reducción de la inflamación mejora el efecto anticancerígeno de Dox.

El corazón de los mamíferos utiliza una gran cantidad de energía para una contracción continua, y el estrecho acoplamiento entre la producción de ATP y la contracción cardíaca es esencial para el funcionamiento adecuado del corazón.). Este proceso requiere una regulación precisa por parte de la red de metabolismo energético cardíaco. La característica más sorprendente de esta red es su flexibilidad metabólica en respuesta a una variedad de estímulos, incluidos cambios en el desarrollo y el estado nutricional, y la capacidad del corazón para remodelar las vías metabólicas para regular la energía miocárdica y la función sistólica en condiciones fisiopatológicas crónicas.). Esta remodelación metabólica contribuye a la preservación de la función cardíaca o acelera la progresión de la enfermedad. Existen muchos estudios sobre enfermedades cardíacas, como la hipertrofia cardíaca y la insuficiencia cardíaca, pero ha habido poca investigación sobre la CID. Estudios de investigación anteriores se han centrado en la producción de ROS y la focalización de la topoisomerasa II-β, que resultan en daño al ADN, disfunción mitocondrial y Ca.2+ mal manejo. Sin embargo, los quelantes de hierro que eliminan ROS y el modulador de la topoisomerasa II-β dexra no logran proporcionar beneficios significativos, lo que sugiere que también están involucrados otros factores. Se desconoce cómo Dox regula la red metabólica en el miocardio, cómo la remodelación de esta red metabólica afecta la eficiencia de producción de energía del corazón y si Dox promueve la cardiotoxicidad. Estudios recientes han revelado que la ferroptosis de los cardiomiocitos causada por la acumulación de peroxidación lipídica juega un papel importante en la progresión de la CID, lo que sugiere que los cardiomiocitos expuestos a Dox tienen una tendencia a mejorar el metabolismo de los lípidos.). Nuestros hallazgos aclaran aún más que la cardiotoxicidad inducida por Dox está impulsada por un circuito de retroalimentación vicioso de desregulación del metabolismo de la glucosa y los lípidos y un aumento resultante en el consumo de oxígeno, una producción ineficiente de energía y un aumento de los niveles de estrés oxidativo.

La breviscapina es el fármaco clásico más utilizado para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares en China, está incluido en la Farmacopea China y en la Lista Nacional de Medicamentos Esenciales y es un medicamento esencial para el tratamiento de emergencia en los hospitales chinos. Nuestro estudio encontró que la breviscapina mejora la eficiencia de la producción de ATP al regular el circuito AKT serotonina-glucémico-miocárdico, remodelando el metabolismo energético del miocardio, aumentando la utilización de glucosa y reduciendo la oxidación de lípidos. Alivia los efectos de la baja producción de ATP, el alto consumo de oxígeno y el alto estrés oxidativo causados por el metabolismo inadecuado de grandes cantidades de lípidos en el corazón causado por la exposición a Dox, reduce la expresión de AMPK, bloquea el círculo vicioso de la absorción excesiva de lípidos en el miocardio y retarda el desarrollo de DIC (). Además, nuestros resultados sugieren que la serotonina puede actuar como una rama suplementaria de la insulina para regular la glucosa en sangre, que suministra glucosa en sangre al corazón y otros órganos importantes en condiciones patológicas. La serotonina tiene efectos contradictorios sobre la regulación de la glucosa en sangre. Por un lado, interactúa con la insulina para reducir los niveles de glucosa en sangre; por otro lado, hace que otros tejidos además del hígado y los músculos esqueléticos absorban glucosa y eleven los niveles de azúcar en sangre. Esto sugiere que la reducción de los niveles séricos periféricos, como mediante el tratamiento con breviscapina, puede ayudar a la utilización de la glucosa por los órganos. Además, el efecto inhibidor de la breviscapina sobre la cardiotoxicidad depende de la mejora de la autofagia mitocondrial, y la remodelación metabólica cardíaca por sí sola no puede conducir a la eliminación de las mitocondrias acumuladas en el contexto de la lesión cardíaca causada por Dox. La breviscapina induce la autofagia en vivo para restaurar la homeostasis mitocondrial miocárdica a través de la vía PINK1/Parkin, aliviando la cardiotoxicidad causada por la doxorrubicina. Teniendo en cuenta que la activación de la autofagia está implicada en la aparición y el desarrollo de una variedad de enfermedades, la breviscapina puede ser un fármaco candidato para las enfermedades relacionadas con la autofagia mitocondrial, lo que le confiere un muy buen valor de aplicación clínica. Estudios recientes han demostrado que la breviscapina tiene ciertos efectos inhibidores sobre el crecimiento tumoral y el comportamiento biológico de las células tumorales (). Los resultados de este estudio demostraron que la breviscapina puede prevenir la disfunción cardíaca inducida por la doxorrubicina en modelos tumorales de cáncer de mama y reducir los niveles de factores inflamatorios y la infiltración de macrófagos inmunosupresores al eliminar las mitocondrias dañadas, ejerciendo un efecto sinérgico con el efecto antitumoral de la doxorrubicina. La breviscapina reduce el crecimiento tumoral al proporcionar una doble ventaja terapéutica en el cáncer, previniendo la cardiotoxicidad de las antraciclinas. La breviscapina protege contra la cardiotoxicidad inducida por antraciclinas y ejerce un efecto antitumoral sinérgico contra las antraciclinas, lo que le confiere un buen valor de aplicación clínica.

 

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a W-SS, Instituto del Cáncer del Hospital Afiliado de la Universidad de Qingdao, China, por la preparación del borrador original y la curación de datos.

 

Declaración de disponibilidad de datos

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo/Material suplementario; Se pueden dirigir más consultas al autor correspondiente.

 

Declaración de Ética

Los estudios con participantes humanos fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética del Hospital Afiliado de la Universidad de Qingdao. Los pacientes/participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio. El estudio en animales fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Qingdao.

 

Contribuciones de autor

M-JL y W-SS operaron todos los experimentos, analizaron datos y escribieron el borrador original. Y-KZ analizó los datos y redactó el borrador original. YY analizó los datos. QL analizó e interpretó los datos de los animales. Y-ZG realizó experimentos con animales. TY realizó experimentos con animales. D-MX -revisó y editó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

 

Fondos

Esta investigación recibió una subvención específica de agencias de financiación de la institución oncológica de Qingdao y del Proyecto de Investigación Aplicada Postdoctoral de Qingdao (Nº RZ2100005362).

 

Conflicto de intereses

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un potencial conflicto de intereses.

 

nota del editor

Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son exclusivas de los autores y no necesariamente representan las de sus organizaciones afiliadas, ni las del editor, los editores y los revisores. Cualquier producto que pueda evaluarse en este artículo, o afirmación que pueda hacer su fabricante, no está garantizado ni respaldado por el editor.

 

Material suplementario

El material complementario de este artículo se puede encontrar en línea en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.930835/full#supplementary-material

Referencias

 

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