Optimización de la extracción de quercitrina y flavonoides totales de Herba Polygoni Capitati mediante metodología de superficie de respuesta

Abstracto

Objetivo:

Optimizar las condiciones para la extracción de quercitrina y flavonoides totales (TF) de Herba Polygoni Capitati (Touhualiao en chino) mediante el uso de la metodología de superficie de respuesta (RSM).

Materiales y métodos:

Se adoptó un diseño compuesto central (CCD) para investigar los efectos de tres variables independientes, incluida la composición del disolvente (%), la relación disolvente-material (ml/g) y el tiempo de extracción (min), sobre las respuestas, la quercitrina y los rendimientos de TF.

Resultados:

Las condiciones optimizadas de la extracción son las siguientes: Concentración de etanol, 65.63%; relación disolvente-material, 10,55:1 (ml/g); tiempo de extracción, 54,33 min. El modelo matemático establecido describió bien los factores de los parámetros experimentales y proporcionó una predicción estadísticamente precisa de los rendimientos óptimos de quercitrina y TF.

Conclusión:

Los valores experimentales coincidieron con los predichos por el modelo matemático establecido, indicando así la idoneidad del modelo empleado y el éxito de RSM en la optimización de las condiciones de extracción.

Palabras clave: Diseño compuesto central, Extracción, Herba Polygoni Capitati, Optimización, Metodología de superficie de respuesta

INTRODUCCIÓN

Herba Polygoni Capitati, la parte aérea o la planta entera de poligonum capitatum Buch.-Jamón. ex D. Don, se ha utilizado como una de las medicinas tradicionales chinas (MTC) durante mucho tiempo en China, especialmente en algunas regiones de minorías étnicas. Los componentes químicos activos de Herba Polygoni Capitati se identificaron como flavonoides, ácidos fenólicos y taninos.,,] en el que los flavonoides fueron considerados los principales compuestos bioactivos. Los estudios farmacológicos y clínicos indicaron que la quercetina y sus glucósidos eran compuestos bioactivos que poseían propiedades anticancerígenas.,] antioxidante[,] y actividades moduladoras de enzimas.[,,] Los estudios epidemiológicos también muestran una relación inversa entre la ingesta elevada de flavonoides (principalmente quercetina) y las enfermedades cardiovasculares.[]

Los extractos de medicina tradicional china se han utilizado en curas tradicionales y remedios a base de hierbas durante siglos en todo el mundo.,] y en este sistema terapéutico se han acumulado muchas experiencias valiosas. Se extrajo y aisló efedrina, un estimulante similar a la anfetamina que se utiliza como descongestionante para los medicamentos para el asma, de una hierba medicinal china. Efedrae herba.[] El extracto de Ginkgo biloba, especialmente el EGb 761 estandarizado fue uno de los remedios herbales más utilizados para la demencia y el deterioro cognitivo.] Dado que muchos factores, como la composición del disolvente, el tiempo de extracción, la temperatura de extracción y la relación disolvente-material, pueden influir significativamente en la eficacia de la extracción, los parámetros de extracción deben optimizarse para obtener más ingredientes de valor profiláctico o terapéutico en seres humanos.[]

De todos los compuestos presentados en Herba Polygoni Capitati, los ácidos fenólicos y los componentes flavonoides recibieron la mayor atención y se consideraron de importancia por sus efectos farmacológicos.] La extracción de ácido gálico (GA) o TF de Herba Polygoni Capitati solo con un enfoque de un factor a la vez,[] o asociado con el diseño ortogonal,[] ha sido informado anteriormente. El enfoque de un factor a la vez, en el que sólo un factor es variable a la vez mientras se mantienen constantes todos los demás factores.] lleva mucho tiempo y puede dar lugar a conclusiones engañosas, ya que no incluye efectos interactivos entre los factores. El diseño ortogonal es útil en el diseño de pruebas[] pero no ofrece predicción a partir de la ecuación del modelo. La metodología de superficie de respuesta (RSM), un conjunto de técnicas estadísticas y matemáticas, puede superar estos inconvenientes, ya que tiene en cuenta los posibles efectos de interacción entre variables.,] RSM puede obtener el gráfico de superficie de respuesta y el gráfico de contorno de la respuesta en función de los parámetros independientes.[] En el presente estudio, se aplicó el enfoque RSM para optimizar las condiciones de extracción (proporción de solvente, relación solvente-material, tiempo de extracción, etc.) de Herba Polygoni Capitati con el fin de maximizar los rendimientos de quercitrina y TF simultáneamente.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y productos químicos.

Herba Polygoni Capitati, identificada botánicamente por el profesor Deyuan Chen, se obtuvo de Guizhou Warmen Pharmaceutical Corporation, Guizhou, China. Toda la planta de Herba Polygoni Capitati se secó en un horno universal con convección forzada (101-2AB Taijin, China) a 50°C durante 4 h. La muestra seca se molió en un molino rotatorio (DFY-200 Wenling, China) y el polvo se tamizó. Para el estudio se recogieron partículas con tamaños entre 10 y 40 mesh (0,3~2 mm, id). Los compuestos de referencia quercitrina (111538-200403) y rutina (080-9303) se adquirieron del Instituto Nacional para el Control de Productos Biológicos y Farmacéuticos de China (Beijing, China). El acetonitrilo y el metanol fueron de calidad HPLC (Tedia, EE. UU.). El agua era robusta bebiendo agua pura (Le Bai Shi Food and Beverage Ltd., Guangdong). El ácido fórmico era de grado MS (Roe Scientific Inc, EE. UU.). Todos los demás productos químicos y disolventes eran de calidad analítica y estaban disponibles comercialmente.

preparación de la muestra

Se pesó con precisión el polvo de Herba Polygoni Capitati de 2 g y se extrajo en determinadas condiciones; posteriormente, el extracto se centrifugó a 3500 rpm durante 10 min. El sobrenadante se recogió y se filtró a través de papel de filtro para su posterior análisis.

Aparato

Los sistemas analíticos utilizados en este estudio fueron los siguientes: Los espectros UV-Vis se registraron en un espectrofotómetro de doble haz (Cary 100-Varian) con celdas de 1 cm de longitud de trayectoria. Para adquirir cromatogramas se utilizó un sistema UHPLC-DAD serie DIONEX/UltiMate 3000 que consta de un desgasificador de vacío, una bomba cuaternaria, un muestreador automático, un compartimento de columna termoestable y un detector DAD (DIONEX, ThermoFisher, Sunnyvale, EE. UU.).

Determinación del contenido total de flavonoides.

El contenido total de flavonoides (TFC) se determinó según el método colorimétrico de aluminio descrito anteriormente[,,,] con modificaciones. Brevemente, se mezcló una alícuota (0,5 ml) de cada extracto de planta con 4,3 ml de disolvente relacionado, seguido de la adición de 0,1 ml de cloruro de aluminio 10% (AlCl3) y 0,1 ml de acetato de sodio 1 M (CH3 COONa). Se utilizó rutina como estándar de referencia. Después de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la mezcla de reacción se midió a 405 nm frente a un blanco. El valor de TFC de cada muestra se calculó y expresó como miligramos de equivalentes de rutina por gramo de material seco (MS).

Separación cromatográfica

Los análisis por HPLC de los extractos se llevaron a cabo utilizando la serie DIONEX/UltiMate 3000. La separación se realizó en un ZORBAX SB-C.18 columna (150 mm × 4,6 mm, 5 μm; Agilent, CA, EE. UU.) con un caudal de 1,0 ml/min. La fase móvil consistió en una combinación de A (acetonitrilo) y B (ácido fórmico 0,2% en agua). El gradiente lineal fue de 5% a 15% A (v/v) a los 5 min, a 16% A a los 10 min, a 20% A a los 20 min y luego se mantuvo a 20% A a 22 min. Cada ejecución fue seguida por un tiempo de equilibrio de 5 min. La longitud de onda del detector UV se ajustó a 260 nm y la temperatura del horno de columna se mantuvo a 30°C. Las muestras se filtraron antes de la inyección (filtro de jeringa de PTFE; 0,45 μm; Hanbon Ltd, China; 013045). Los datos fueron recolectados y analizados con el software Chromeleon 7.1.

Preparación de soluciones estándar.

Se prepararon soluciones madre estándar de rutina y quercitrina en metanol, en concentraciones de 190,8 µg/ml y 106,0 µg/ml, respectivamente. La curva estándar de quercitrina y TF se calibró utilizando la ecuación de regresión lineal de mínimos cuadrados derivada del área del pico y la absorbancia, respectivamente, las concentraciones de quercitrina y TF en las muestras se calcularon de acuerdo con la curva estándar.

Selección de condiciones de extracción adecuadas.

Antes del desarrollo del estudio mediante RSM, se realizaron una serie de pruebas preliminares para seleccionar las variables independientes relevantes y determinar sus rangos experimentales. El paso inicial del experimento preliminar fue seleccionar un método apropiado para la extracción de Herba Polygoni Capitati. Se probaron tres enfoques diferentes, a saber, maceración, reflujo y extracción por sonicación. El segundo paso del experimento preliminar fue seleccionar un disolvente de extracción apropiado para Herba Polygoni Capitati. Utilizando una serie de disolventes de extracción que varían en el rango de 0-100% (etanol o metanol en agua), se determinó el mejor disolvente. En tercer lugar, el factor de la relación disolvente-material (6:1, 8:1, 10:1, 12:1, 14:1; v/m) en la extracción se investigó utilizando etanol: agua (70:30, v/v) como disolvente en la condición de extracción por sonicación durante 30 minutos a temperatura ambiente. En cuarto lugar, se seleccionó un tamaño de partícula adecuado para futuras investigaciones. Finalmente, también se probó la duración de la extracción (10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min).

Con base en estos resultados, se seleccionaron tres niveles (inferior, medio, superior) de cada variable relevante para el diseño compuesto central (CCD) para analizar el patrón de respuesta y establecer un modelo.

análisis estadístico

Los datos experimentales obtenidos de los procedimientos CCD se analizaron utilizando RSM para ajustar el siguiente modelo polinómico de segundo orden (ecuación (1) y los coeficientes de regresión obtenidos.

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donde x1, X2,…, Xk son las variables independientes codificadas que afectan la respuesta Y; b0, βi (yo = 1, 2,…, k), βii (i = 1, 2,…, k) y βyo (i = 1, 2,…, k) son los coeficientes de regresión para los términos de intersección, lineal, cuadrático y de interacción, respectivamente; k es el número de variables.

Se utilizó el software Design Expert versión 8.0.5b (STAT-EASE Inc.) para la regresión y el análisis gráfico de los datos experimentales. La calidad de la aptitud del modelo se evaluó utilizando los coeficientes de determinación (R2) y análisis de varianza (ANOVA). Las superficies de respuesta y los gráficos de contorno se desarrollaron utilizando la ecuación polinómica cuadrática ajustada.

 

RESULTADOS Y DISCUSIONES

Precisión del sistema, linealidad de HPLC o UV-Vis.

Se designaron quercitrina y TF como marcadores para la evaluación de la eficiencia de extracción. Los perfiles de HPLC del estándar de referencia y del extracto de Herba Polygoni Capitati se muestran en Figura 1. La curva de calibración del área del pico frente al nivel de quercitrina fue y = 47.622 X − 0,2231 con rango lineal de 0,033-1,06 μg (R2 = 1.0000, y = área de pico y X = cantidad de quercitrina). La curva de calibración de absorbancia frente a la cantidad de TF fue y = 0.0029 X – 0,0088 con rango lineal de 74,32-267,12 μg (R2 = 0.9996, y = absorbancia y X = monto del TF).

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Cromatogramas de HPLC del compuesto de referencia autenticado de quercitrina (a) y el extracto de Herba Polygoni Capitati (b) a 260 nm

Determinación de parámetros y selección de niveles.

 

Efecto de los métodos de extracción.

Se probaron tres métodos diferentes de extracción, incluida la maceración, el reflujo y la extracción por sonicación, con los siguientes valores de parámetros: tamaño de partícula, malla 10; relación disolvente-material, 10:1 (ml/g); duración de la extracción, 30 min para extracción a reflujo y sonicación, 12 h para extracción por maceración; composición disolvente, etanol acuoso 70%; temperatura, temperatura ambiente. La cantidad de quercitrina y TF extraídos por gramo de MS se presentó en Figura 2. ANOVA para los resultados experimentales mostró diferencias significativas entre estos tres métodos de extracción (PAG < 0,01). Mientras tanto, el método de extracción por sonicación dio los mayores rendimientos de quercitrina y TF, por lo que fue seleccionado como nuestro método de extracción.

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Efecto de diferentes métodos de extracción de quercitrina (izquierda) y TF (derecha) de Herba Polygoni Capitati

 

Efecto de los disolventes de extracción.

El disolvente es un factor clave que afecta la recuperación de analitos. En el presente estudio se probaron agua, diferentes concentraciones de metanol y diferentes concentraciones de etanol. Como se muestra en figura 3, la eficiencia de extracción del etanol acuoso 60% fue la más alta. Por lo tanto, se seleccionaron etanol 50%, 60% y 70% como los niveles inferior, medio y superior de la composición del solvente para una mayor investigación de RSM.

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Influencia de la composición del disolvente en la extracción asistida por ultrasonido de quercitrina y TF de Herba Polygoni Capitati

 

Relaciones disolvente-material

El impacto de las proporciones disolvente-material en la extracción se probó con cinco valores (6:1, 8:1, 10:1, 12:1, 14:1; v/m). Se seleccionaría un valor de relación disolvente-material adecuado en función de las reglas [] que el valor no debería ser ni demasiado pequeño (los compuestos bioactivos no se pueden extraer por completo) ni demasiado alto (el coste de procesamiento sería insoportable). Como se presenta en Figura 4, se observó una tendencia creciente en los rendimientos de quercitrina y TF, alcanzando los valores más altos cuando la relación era de aproximadamente 10:1. Una explicación probable fue que un aumento en la relación solvente-material puede aumentar la difusividad del solvente en las células y mejorar la desorción de los compuestos fenólicos de las células.] En el presente estudio, se observó una ligera disminución en los rendimientos de quercitrina y TF cuando el valor de la relación fue superior a 10:1, lo que podría deberse a una mayor pérdida en la recolección del producto o en la operación del proceso. Por lo tanto, la relación disolvente-material se estableció en 10:1 como nivel medio para RSM en estudios posteriores.

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Efecto de la relación disolvente-material sobre el rendimiento de quercitrina y TF

 

Efecto del tamaño de partícula

El tamaño de las partículas es otra variable importante a considerar. Generalmente, la eficiencia de extracción aumenta con la disminución del tamaño de las partículas.Figura 5]. En el presente estudio, el tamaño de partícula se fijó entre 0,45 y 0,9 mm de diámetro.

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Efecto del tamaño de partícula sobre el rendimiento de quercitrina y TF.

 

Efecto del tiempo de extracción.

La selección de un momento de extracción apropiado fue el paso final de nuestro estudio preliminar. Se probaron diferentes duraciones de extracción a 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos para examinar el valor óptimo. Los resultados mostraron que los rendimientos de quercitrina y TF aumentaron con la prolongación del tiempo de extracción de 10 a 50 min.Figura 6]. Al nivel de 50 min, los rendimientos de quercitrina y TF alcanzaron la cantidad más alta. Por lo tanto, se seleccionaron 40, 50 y 60 minutos como los niveles inferior, medio y superior de tiempo de extracción.

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Efecto del tiempo de extracción sobre el rendimiento de quercitrina y TF.

Optimización de parámetros de extracción por RSM.

 

Resultados de regresión lineal múltiple y análisis de la adecuación del modelo ajustado.

Se empleó un CCD giratorio de tres factores y tres niveles que constaba de 20 corridas experimentales con 6 repeticiones en el punto central. Los efectos de la variabilidad inexplicable se minimizaron al aleatorizar el orden de los experimentos. Las variables independientes fueron la composición del solvente (X1, %, v/v, etanol/agua), la relación disolvente-material (X2, ml/g) y el tiempo de extracción (X3, min) con rendimientos de quercitrina y TF como indicadores. Se eligió un tamaño de partícula fijo (0,45-0,9 mm). Los rendimientos de quercitrina y TF de todas las series se muestran en tabla 1. Las regresiones lineales múltiples utilizando el modelo polinomial de segundo orden (ecuación (1)) se realizaron en base a estos resultados.

 

tabla 1

Configuración de diseño compuesto central giratorio en la forma original y codificada de las variables independientes (X1, X2, X3) y resultados experimentales para las variables de respuesta, quercitrina y TF

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Un ANOVA de variables independientes que se muestra en Tabla 2 indica que estas tres variables independientes afectan significativamente la eficiencia de extracción (PAG < 0,05). Los parámetros de regresión de los modelos cuadráticos ajustados con los coeficientes correspondientes de determinaciones múltiples (R2) se mostraron en Tabla 3. Se lograron buenos ajustes y el modelo explicó la variabilidad de la respuesta. La altura R2 Los valores, 0,94 y 0,96 para quercitrina y TF, respectivamente, implican que los datos experimentales confirman la compatibilidad con los datos predichos por el modelo. El bajo valor del coeficiente de variación (1,92% para quercitrina, 3,28% para TF) indica que los resultados obtenidos del modelo ajustado fueron confiables. El coeficiente de determinación ajustado (R2 Adj.) valor reconstruye la expresión con todos los *términos significativos incluidos y el valor alto del R2 Adj. (R2 Adj. igual a 87%, 92%, respectivamente) respalda la importancia del modelo.

 

Tabla 2

Análisis de varianza para el modelo cuadrático de superficie de respuesta.

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Tabla 3

Coeficientes de regresión del modelo de segundo orden predicho para las variables de respuesta, quercitrina y TF

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Se utilizó la prueba de falta de ajuste para verificar la adecuación del fitness del modelo. El ANOVA para la prueba de falta de ajuste no fue significativo con respecto a los rendimientos de quercitrina y TF (PAG > 0,05), lo que indica que el modelo podría ajustarse adecuadamente a los datos experimentales [Tabla 4].

 

Tabla 4

Análisis de varianza por falta de pruebas de ajuste para quercitrina y TF

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Análisis de superficies de respuesta.

Desde; los modelos muestran buenos ajustes, los valores de respuesta están suficientemente explicados por la ecuación de regresión. Las curvas de superficie de respuesta se trazaron para demostrar las interacciones de las variables independientes y determinar el valor óptimo de cada variable independiente para la respuesta máxima. La relación entre las variables independientes y dependientes se ilustró en gráficos de superficie de respuesta tridimensionales (3D) y gráficos de contorno bidimensionales (2D). La superficie de respuesta 3D y los gráficos de contorno 2D se proporcionaron como representaciones gráficas de la ecuación de regresión [Figuras [Figuras77 y y8].8]. Cada curva de nivel representaba un número infinito de combinaciones de dos variables independientes manteniendo la otra variable independiente en el punto estacionario. De esa manera, se puede visualizar fácilmente una superficie de respuesta 3D. Figura 7a muestra la función de superficie de respuesta 3D desarrollada por el modelo para la composición de solvente y la relación solvente-material. La composición del disolvente demostró efectos cuadráticos sobre la respuesta. El contenido de quercitrina alcanza el valor más alto cuando se utiliza etanol 65%. De manera similar, la relación solvente-material demostró efectos cuadráticos sobre la quercitrina al mismo tiempo. Los resultados de los efectos de la composición del solvente y la relación solvente-material en los TF se muestran en Figura 8a. La composición del solvente mostró un efecto cuadrático en la respuesta, produciendo un máximo entre etanol 60% y 70%. De manera similar, cuando la composición del disolvente se fijó con el aumento de la relación disolvente-material, el TF aumentó gradualmente y alcanzó el valor más alto cuando la relación disolvente-material era de aproximadamente 10:1.

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Gráficos de superficie de respuesta (a, cy e) y gráficos de contorno (b, d y f) que muestran el efecto de la composición del disolvente (X1), la proporción del material disolvente (X2) y el tiempo de extracción (X3) sobre el rendimiento de quercitrina.

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Gráficos de superficie de respuesta (a, cy e) y gráficos de contorno (b, d y f) que muestran el efecto de la composición del solvente (X1), la proporción del material solvente (X2) y el tiempo de extracción (X3) sobre el rendimiento de TF.

Los efectos de las variables independientes, composición del solvente y tiempo de extracción sobre los valores de respuesta de quercitrina y rendimiento de TF se muestran en las Figuras. Figuras 7c,7c,7d,7d,8c,8c,8d,8d, respectivamente. La relación interactiva entre las dos variables independientes se puede entender fácilmente examinando los gráficos de contorno generados al mantener constante la otra variable independiente, la relación solvente-material, en el punto estacionario [Figuras [Figuras7d7d y y8d].8d]. Se logró significativamente un aumento en los rendimientos de quercitrina y TF con los aumentos de la composición del solvente y el tiempo de extracción. Sin embargo, los rendimientos de quercitrina y TF ya no aumentan cuando las variables independientes exceden ciertos valores. La interacción entre la composición del disolvente y el tiempo de extracción no fue estadísticamente significativa para afectar el rendimiento de quercitrina, pero sí fue significativa (PAG < 0,01) efecto sobre la extracción de TF.

Cifras Figuras7e7e y and8e8e demostró el efecto de la relación disolvente-material y el tiempo de extracción sobre los rendimientos de quercitrina y TF. Se observaron aumentos en los rendimientos de quercitrina y TF con los aumentos en el tiempo de extracción y la relación solvente-material, lo que sugiere que los rendimientos de extracción de quercitrina y TF fueron proporcionales al tiempo de extracción y la proporción solvente-material. La interacción de las dos variables independientes sobre la extracción de quercitrina y TF de Herba Polygoni Capitati no fue estadísticamente significativa.

Experimentos de verificación

Para verificar la capacidad predictiva del modelo, se probaron las variables de respuesta óptima bajo las condiciones optimizadas derivadas del análisis de crestas de RSM. Como resultado, los valores observados se pudieron lograr satisfactoriamente dentro del intervalo de confianza 95% de los valores predichos del modelo [Tabla 5].

 

Tabla 5

Comparación entre el valor predicho y el valor observado para las variables de respuesta, quercitrina y TF

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CONCLUSIONES

Mediante el uso de un enfoque de un factor a la vez junto con CCD, se optimizaron los parámetros de extracción asistida por ultrasonido, incluida la composición del solvente, la relación solvente-material y el tiempo de extracción para la extracción de quercitrina y TF de Herba Polygoni Capitati. Los resultados mostraron que el modelo polinomial de segundo orden dio una descripción satisfactoria de los datos de extracción. Las condiciones optimizadas son las siguientes: método de extracción, extracción por sonicación; solvente, podría ser bueno redondear a etanol acuoso 65%; tamaño de partícula, 0,45-0,9 mm; relación disolvente-material, redondeada a 10:1; tiempo de extracción, redondeado a 54 min. Este estudio puede proporcionar información fundamental y conocimientos valiosos sobre los procesos de extracción industrial de Herba Polygoni Capitati.

 

EXPRESIONES DE GRATITUD

Los autores agradecen a Guizhou Warmen Pharmaceutical Corporation por proporcionar materias primas y el apoyo financiero del Programa Especial Principal de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guizhou (No. 2011 6019-02), Equipo de Talento de Innovación en Ciencia y Tecnología del Programa Provincial de Guizhou en Análisis Farmacéutico (No. . 2011 4008), Programa Especial Provincial de Guizhou sobre Investigación y Desarrollo de la Industria Científica y Tecnológica sobre la Modernización de las MTC (Nº ZY 2011 3013), el Laboratorio Clave de Características de Normalización de Medicinas Tradicionales Chinas y Medicinas Nacionales y el Laboratorio Clave de Características de Guizhou Departamento de Educación de la Provincia. (Nº KY 2012 005).

 

Notas a pie de página

Fuente de apoyo: Nulo

Conflicto de intereses: Ninguno declarado.

 

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