黄金藻通过抑制 NF-κB 对干眼综合征的保护作用

材料

体内/体外材料

黄毛虫 获自Microalgae Ask us Corp.（韩国江陵）。东莨菪碱、荧光素、苏木精和伊红 (H&E) 购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），用于动物实验。杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)：F12、杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水 (DPBS)、胎牛血清 (FBS) 和 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液获自 Life Technologies（卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）。抗生素溶液包含 10,000 U/mL 青霉素和 10,000 μg/mL 链霉素，购自 Hyclone Laboratories Inc.（美国犹他州南洛根）。重组人 TNF-α 获自研发系统（明尼苏达州明尼阿波利斯市，美国）。一抗包括抗细胞外信号调节激酶（ERK）、抗c-jun N末端激酶（JNK）、抗p38、抗α-微管蛋白和抗β-肌动蛋白，购自Santa Cruz Biotechnology（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。其他一抗和辣根过氧化物酶 (HRP) 缀合的二抗购自 Cell Signaling Technology, Inc（美国马萨诸塞州贝弗利）。包括 3–4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 (MTT) 在内的化学品购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。

化学分析材料

PUFA 使用含有 37 种 PUFA 标准物质的溶液进行鉴定，该溶液购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。戊酸购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），用作内标。溶剂，包括三氟化硼甲醇溶液， n-己烷、Na₂所以₄,CH₃Cl、MeOH 和 NaCl，用于从其中提取 PUFA 黄毛虫 购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。

道德声明

这项研究得到了韩国科学技术研究院 (KIST) 机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准：KIST No. 2020-002、江陵研究所，并遵循视觉和眼科研究协会关于动物在眼科和视力研究中的使用。此外，我们遵循动物研究：体内实验报告 (ARRIVE) 建议。所有程序均按照适用的法规和准则进行。

动物实验及DES模型诱导

将小鼠饲养在装有空调的动物房中，维持在22℃±2℃、50%±10%湿度和12小时光照/12小时黑暗昼夜节律周期。随意提供食物和水。小鼠适应一周后被随机分为五组，每组七只 6 周龄雄性 BALB/c 小鼠（Orientbio，Gyunggi-do，韩国）。通过腹腔注射 200 μL (2.5 mg/mL) 稀释于磷酸盐缓冲盐水（PBS；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）的东莨菪碱，在小鼠中实验诱导 DES，每天两次。 黄毛虫 每天以 0（载体对照）、100、150 或 300 mg/kg 的浓度（溶于 200 μL 蒸馏水）口服给予小鼠组。对照组接受不含东莨菪碱的PBS。什么时候 黄毛虫 口服给药，对照组和DES组使用200μL蒸馏水。两周后，在闭眼 1 分钟之前，使用放置在颞眼睑下三分之一处的标准 Schirmer 测试条对泪液产生进行量化。然后取出条带并测量湿点的长度（以毫米为单位）以确定席尔默的测试值。角膜表面的染色用于确定角膜表面变化的程度。下外侧结膜注射1滴3%荧光素后观察角膜表面并评分。盲目评估角膜染色。通过颈椎脱位处死小鼠。通过轻弹小鼠眼睑并使用镊子从眼球切出视神经并去除角膜来去除角膜。将晶状体从角膜内取出并保存在−80°C 下。使用镊子从小鼠的下颌取出泪腺，并切掉拉动区域的表皮以露出下半张脸。固定并取出下颌附近的泪腺，然后避光保存在− 80°C 下。

组织学

收集角膜表皮和泪腺组织并固定在10%甲醛中，然后进行石蜡包埋和切片处理。切片用 H&E 染色，并使用显微镜（TE-2000U，尼康，东京，日本）在 40 倍放大倍数下进行检查。通过将每个角膜分为五个部分来确定中央角膜上皮厚度。

用于免疫组织化学 (IHC) 分析的 DAB 染色

取BALB/c小鼠泪腺组织并用10%甲醛固定。将固定的泪腺组织石蜡包埋，切片（5μm），并使用二甲苯去除石蜡3次，每次3分钟（Junsei，Tokyo，Japan）。将切片在 100、95、70 和 50% 乙醇中水合 1 分钟。使用 TRIS-EDTA 缓冲液（pH 9.0）微波提取泪腺抗原。将 3% 过氧化氢应用于组织玻片 15 分钟后，用 2% BSA 在室温下封闭切片 1 小时。将切片在 4°C 下用 CD45（Bio-RAD，MCA 1258GT，1:100 稀释）处理过夜。用PBS洗涤后，用抗兔IgG-HRP（Santa Cruz Biotechnology，Dallas，TX，USA，SC-2357，1:100稀释）在室温下处理细胞2小时，并用3，染色1分钟， 3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（Vector Laboratories，伯林格姆，加利福尼亚州，美国）。将载玻片用苏木精染色30秒并用自来水冲洗。然后将切片盖上盖玻片并用 Permount™ 封片剂（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）封片。使用光学显微镜（Olympus，CX43，Olympus Optical Co.，东京，日本）检查所有载玻片并拍照。 ImageJ 软件（版本 1.53，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州）⁴⁸ 用于进行定量数据分析。

ARPE-19 细胞培养

人视网膜上皮 ARPE-19 细胞（美国典型培养物保藏中心，ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国）在补充有 10% FBS（HyClone Laboratories，Logan，UT）的 DMEM/F-12 培养基（Gibco，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）中培养，美国）和 1% 青霉素/链霉素（HyClone Laboratories）。细胞接种密度为 2 × 10⁵ 6 孔板中的每孔并培养以诱导炎症和内质反应。

细胞活力

的效果 黄毛虫 如之前的研究所述，通过 MTT 测定评估对细胞活力的影响⁴⁹ 但略有修改。将细胞以 1.5 × 10 的密度接种于 96 孔培养板中⁴ 细胞/孔并孵育 24 小时。然后用不同浓度的 黄毛虫 并再孵育24小时。每孔上清液更换为含有0.5 mg/mL MTT的新鲜生长培养基，并孵育1 h。除去上清液并将生成的甲臜沉积物溶解在200μL二甲基亚砜中。在 570 nm 处测量吸光度。与阴性对照组相比，细胞活力相对计算为百分比。

蛋白质印迹分析

进行蛋白质印迹以确定抗炎作用背后的细胞信号通路 黄毛虫 如先前研究所述⁴⁹，但稍作修改。将汇合的 ARPE-19 细胞在含有 1% FBS 和 1% 抗生素的 DMEM:F12 中饥饿 24 小时。然后用处理细胞 黄毛虫 （50 和 100 μg/mL）2 小时，然后用 20 ng/mL TNF-α 刺激 15 分钟。用冰冷的 DPBS 冲洗细胞 3 次，然后在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的蛋白质提取缓冲液（iNtRON Biotechnology，京畿道，韩国）中裂解。通过离心（14,000×G，30 分钟，4 °C），并使用 DCTM 蛋白质测定试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）估计其蛋白质浓度。通过 SDS-PAGE 分离等量 (15–25 μg) 的细胞蛋白并转移到 PVDF 膜上。将膜与 5% 牛血清白蛋白或脱脂奶一起孵育，然后与 1:2000 稀释的一抗（抗 phopho-ERK、抗 -ERK、抗 - 磷酸 -JNK、抗 -JNK、抗 - 磷酸 -p38）一起孵育、抗 p38、抗磷酸 AKT、抗 AKT、抗磷酸 IκB-α、抗 IκB-α、抗磷酸 p65、抗 p65、抗 α 微管蛋白和抗 β 作用）在 4°C 和 12 小时。然后用 TBS-T 冲洗膜，并用 1:10,000 稀释度的抗兔 HRP 标记的二抗在室温下处理 1 小时。使用 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific) 检测蛋白质条带，并在 iBright CL1000 凝胶记录系统 (Thermo Fisher Scientific) 中可视化。使用Image J软件（版本1.53，NIH）测定每个蛋白质印迹的密度⁴⁸.

总 PUFA 提取量 黄毛虫

总 PUFA 提取自 黄毛虫 使用福尔奇技术⁵⁰。简而言之，将 100 mg 样品放入含有 5 mL CH 的小瓶中₃Cl:MeOH (2:1, v/v) 溶液并超声处理 15 分钟。通过以 10,000 rpm 离心 5 分钟使悬浮液澄清。钠₂所以₄ 将其添加到上清液中，然后过滤以除去任何剩余的水。该步骤再重复两次。然后在氮气下浓缩溶液以获得纯的藻脂。

脂肪酸甲基化

进行脂肪酸甲基化以制备用于气相色谱（GC）分析的脂质样品。将提取的物质添加到 10 mL 小瓶中，然后添加 1 mL 0.5 N NaOH:MeOH 混合物。该溶液含有 400 μg/mL 的内链（戊酸）。将混合物摇动 30 s，然后在 80 °C 下孵育 20 分钟。然后将混合物在室温下冷却5分钟，然后加入2mL三氟化硼:MeOH，然后搅拌30秒。将混合物在 80°C 下孵育 20 分钟，然后冷却 10 分钟。添加 2 mL 体积的过饱和 NaCl 以诱导相分离和脂肪酸收集。接下来，1.5 mL n添加正己烷并将混合物涡旋30秒，然后在室温下冷却20分钟。分离各层并从混合物中除去液体上清液并使用饱和Na₂所以₄ 筛选。

脂肪酸的鉴定

使用配备火焰离子化检测器的 GC（FID；Agilent 7890A，Agilent Technologies，Wilmington，DE，USA）对脂肪酸甲酯 (FAME) 进行检测。将样品 (1 µL) 注入 GC (J&W 112-88A7, Agilent Technologies, Wilmington, DE, USA) 的 HP-88 色谱柱（100 m × 250 µm ID，0.2 µm 薄膜）。 GC 分析如下进行：样品最初在 140 °C 下保持 5 分钟，然后以 4 °C/min 升温至 240 °C，持续 15 分钟。柱的流速固定为1 mL/min。采用氮气作为分析载气，FID设定为280℃，分流比为30:1。 FAME 是通过与已知标准进行比较来识别的。每个样品均通过 GC 分析一式三份进行测量。

统计分析

所有数据均使用单向方差分析和 Tukey 事后分析通过 SPSS 18.0 版（IBM Co.，Armonk，NY，USA）进行统计分析。每个实验至少进行三次独立重复。