补充剂

响应面法优化头首草中槲皮苷和总黄酮的提取工艺

1 月 16, 2024

抽象的

客观的：

采用响应面法（RSM）优化头花寮中槲皮苷和总黄酮（TF）的提取条件。

材料和方法：

采用中心复合设计（CCD）来研究三个自变量，包括溶剂组成（%）、溶剂材料比（ml/g）和提取时间（min）对响应、槲皮苷和TF产量的影响。

结果：

最佳提取条件为：乙醇浓度65.63%；溶剂-物料比，10.55:1(ml/g)；提取时间，54.33 分钟。建立的数学模型很好地描述了实验参数的因素，并为槲皮苷和TF的最佳产率提供了统计上准确的预测。

结论：

实验值与所建立的数学模型预测值一致，表明所用模型的适用性以及RSM在优化提取条件方面的成功。

关键词： 中心复合设计、提取、蓼、优化、响应面法

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介绍

蓼草（Herba Polygoni Capitati）的地上部分或全草 头花蓼 布赫-火腿。 ex D. Don，在中国，特别是在一些少数民族地区，长期以来一直被用作传统中药（TCM）之一。经鉴定，头首草的活性化学成分为黄酮类、酚酸类和单宁类，[1,2,3] 其中类黄酮被认为是主要的生物活性化合物。药理和临床研究表明槲皮素及其苷类是具有抗癌作用的生物活性化合物。4,5] 抗氧化[6,7] 和酶调节活性。[8,9,10] 流行病学研究还表明，大量摄入黄酮类化合物（主要是槲皮素）与心血管疾病之间呈反比关系。[11]

几个世纪以来，中药提取物一直被用于传统疗法和草药疗法中[12,13]并在这一治疗体系中积累了大量宝贵的经验。麻黄碱是一种苯丙胺类兴奋剂，用作哮喘药物的减充血剂，是从中草药中提取和分离的麻黄.[14] 摘录 银杏叶，尤其是标准化的 EGb 761 是治疗痴呆和认知障碍最广泛使用的草药之一。[15] 由于溶剂成分、提取时间、提取温度、溶剂材料比等许多因素可能显着影响提取效果，因此需要优化提取参数，以获得更多对人体具有预防或治疗价值的成分。[16]

在头蓼中存在的所有化合物中，酚酸和黄酮类成分最受关注，并被认为对其药理作用非常重要。17] 仅以一次一因子的方法从头状草中提取没食子酸 (GA) 或 TF，[18] 或与正交设计相关，[19] 此前已报道过。一次只有一个因素的方法，其中一次只有一个因素是可变的，同时保持所有其他因素不变，[20] 非常耗时，并且可能会导致误导性的结论，因为它不包括因素之间的交互作用。正交设计在测试设计中很有用[21] 但它不提供模型方程的预测。响应面方法 (RSM) 是统计和数学技术的集合，可以克服这些缺点，因为它考虑了变量之间可能的相互作用效应。22,23] 通过RSM可以得到响应作为独立参数函数的响应曲面图和等值线图。[24] 在本研究中，采用RSM方法来优化头花草的提取条件（溶剂比例、溶剂材料比、提取时间等），以同时最大化槲皮素和TF的产量。

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材料和方法

材料和化学品

头蓼经陈德源教授植物学鉴定，购自中国贵州贵州沃曼药业公司。将头首草全草在强制对流通用烘箱（101-2AB Taijin，中国）中于 50°C 干燥 4 小时。将干燥后的样品在旋转磨机（DFY-200温岭，中国）中研磨并过筛粉末。收集尺寸在 10 至 40 目（0.3~2mm，内径）之间的颗粒用于研究。参考化合物槲皮苷（111538-200403）和芦丁（080-9303）购自中国生物制品检定所（中国北京）。乙腈和甲醇为 HPLC 级（Tedia，美国）。水为乐百氏饮用纯净水（广东乐百仕食品饮料有限公司）。甲酸为 MS 级（Roe Scientific Inc，美国）。所有其他化学品和溶剂均为分析级且市售。

样品制备

准确称取头首草粉末2g，在一定条件下提取，3500℃离心。转速 10分钟。收集上清液并通过滤纸过滤用于后续分析。

仪器

本研究中使用的分析系统如下：在双光束分光光度计（Cary 100-Varian）上记录紫外-可见光谱，池长度为 1 cm。 DIONEX/UltiMate 3000 系列 UHPLC-DAD 系统由真空脱气机、四元泵、自动进样器、恒温柱温箱和 DAD 检测器 (DIONEX, ThermoFisher, Sunnyvale, USA) 组成，用于获取色谱图。

总黄酮含量的测定

总黄酮含量（TFC）按照前述铝比色法测定[25,26,27,28] 进行修改。简而言之，将每种植物提取物的等分试样（0.5ml）与 4.3ml 相关溶剂混合，然后添加 0.1ml 10% 氯化铝（AlCl₃）和0.1ml 1M乙酸钠（CH₃ 库纳）。使用芦丁作为参考标准。室温孵育 30 分钟后，将反应混合物在 405 nm 处对照空白进行测量。计算每个样品的 TFC 值并表示为每克干燥材料 (DM) 的芦丁当量毫克数。

色谱分离

使用 DIONEX/UltiMate 3000 系列对提取物进行 HPLC 分析。分离在 ZORBAX SB-C 上进行₁₈ 色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm；Agilent，CA，USA），流速 1.0ml/min。流动相由 A（乙腈）和 B（0.2% 甲酸水溶液）的组合组成。线性梯度为从 5% 到 15% A (体积/体积）5分钟，10分钟16%A，20分钟20%A，然后在20%A保持22分钟。每次运行后都有 5 分钟的平衡时间。紫外检测器的波长设置为260 nm，柱温箱的温度保持在30℃。注射前对样品进行过滤（PTFE 注射器过滤器；0.45 μm；Hanbon Ltd，中国；013045）。使用 Chromeleon 7.1 软件收集和分析数据。

标准溶液的制备

用甲醇制备芦丁和槲皮苷的标准储备溶液，浓度分别为 190.8 μg/ml 和 106.0 μg/ml。分别根据峰面积和吸光度推导线性最小二乘回归方程校准槲皮苷和TF的标准曲线，根据标准曲线计算样品中槲皮苷和TF的浓度。

选择合适的提取条件

在使用 RSM 开展研究之前，进行了一组初步测试以选择相关自变量并确定其实验范围。初步实验的第一步是选择合适的头首草提取方法。测试了三种不同的方法，即浸渍、回流和超声提取。初步实验的第二步是选择合适的首乌提取溶剂。使用0-100%范围内的一系列萃取溶剂（乙醇或甲醇水溶液），确定最佳溶剂。三、溶剂与物料比的因素（6:1、8:1、10:1、12:1、14:1； 体积/米）使用乙醇：水（70：30， 体积/体积）为溶剂，在室温下超声提取30分钟。第四，选择合适的粒径进行进一步研究。最后，还测试了提取持续时间（10 分钟、20 分钟、30 分钟、40 分钟、50 分钟、60 分钟）。

基于这些结果，选择每个相关变量的三个水平（下、中、上）进行中心组合设计（CCD）来分析响应模式并建立模型。

统计分析

使用RSM对从CCD程序获得的实验数据进行分析，以拟合以下二阶多项式模型（式（1））并获得回归系数。

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其中X₁， X₂，…， X_k 是影响响应 Y 的编码自变量； β₀, β_我 (i = 1, 2, …, k), β_二、 (i = 1, 2,…,k) 和 β_ij (i = 1, 2,…, k) 分别是截距项、线性项、二次项和交互项的回归系数； k 是变量的数量。

使用 Design Expert 8.0.5b 版（STAT-EASE Inc.）软件对实验数据进行回归和图形分析。使用决定系数评估模型的适应性质量（右²）和方差分析（ANOVA）。使用拟合的二次多项式方程绘制响应曲面和等高线图。

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结果与讨论

HPLC 或 UV-Vis 的系统精度、线性度

槲皮苷和TF被指定为评价提取效率的标记物。参考标准品和头状蓼提取物的 HPLC 谱显示在图1。峰面积与槲皮苷水平的校准曲线为 y = 47.622 X − 0.2231，线性范围为 0.033-1.06 µg（右² = 1.0000, y = 峰面积和 X = 槲皮甙量）。吸光度与 TF 量的校准曲线为 y = 0.0029 X – 0.0088，线性范围为 74.32-267.12 μg（右² = 0.9996, y = 吸光度和 X = TF 金额）。

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图1

槲皮苷对照品(a)和头花提取物(b)在260nm处的HPLC图谱

参数的确定和水平的选择

提取方法的效果

测试了三种不同的提取方法，包括浸渍、回流和超声提取，参数值如下：粒径，10目；溶剂与物料的比例，10:1（ml/g）；提取时间，回流超声提取30分钟，浸渍提取12小时；溶剂成分，70%乙醇水溶液；温度，室温。每克 DM 中提取的槲皮苷和 TF 的量见下表：图2。实验结果的方差分析显示这三种提取方法之间存在显着差异（磷 < 0.01）。同时，超声提取方法得到的槲皮苷和TF的得率最高，因此选择它作为我们的提取方法。

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图2

不同方法从头花中提取槲皮素（左）和TF（右）的效果

萃取溶剂的影响

溶剂是影响分析物回收率的关键因素。在本研究中，测试了水、不同浓度的甲醇和不同浓度的乙醇。如图所示图3，60%乙醇水溶液的提取效率最高。因此，选择50%、60%和70%乙醇作为下、中、上层溶剂组合物，进行进一步的RSM研究。

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图3

溶剂组成对超声波辅助提取头首草槲皮苷和TF的影响

溶剂与材料的比例

使用五个值（6:1、8:1、10:1、12:1、14:1； 体积/米）。根据规则选择合适的溶剂材料比值[29] 该值既不能太小（生物活性成分不能完全提取出来），也不能太高（加工成本难以承受）。如中所介绍的图4，观察到槲皮苷和TF产量呈增加趋势，当比例约为10:1时达到最高值。可能的解释是，溶剂-材料比例的增加可能会增加溶剂进入细胞的扩散性，并增强酚类化合物从细胞中的解吸。30] 在本研究中，当比例值高于10:1时，槲皮素和TF的产率略有下降，这可能是由于产品收集或工艺操作中的损失较大。因此，后续研究中将溶剂与物料的比例设定为10：1作为RSM的中间水平。

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图4

料料比对槲皮苷和TF收率的影响

粒径的影响

粒度是另一个需要考虑的重要变量。一般来说，萃取效率随着粒径的减小而增加[图5]。在本研究中，粒径设定为直径0.45-0.9毫米。

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图5

粒径对槲皮苷和TF得率的影响

提取时间的影响

选择合适的提取时间是我们初步研究的最后一步。测试了 10、20、30、40、50 和 60 分钟的不同提取长度以检查最佳值。结果表明，随着提取时间从10 min延长至50 min，槲皮苷和TF的得率增加。图6]。在50 min水平时，槲皮苷和TF的产量达到最高量。因此，选取40、50和60 min作为提取时间的下、中、上水平。

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图6

提取时间对槲皮苷和TF得率的影响

通过 RSM 优化萃取参数

多元线性回归结果及拟合模型的充分性分析

采用由 20 次实验运行组成的三因素三级可旋转 CCD，在中心点进行 6 次重复。通过随机化实验顺序，可以最大限度地减少无法解释的变异性的影响。自变量是溶剂成分 (X₁, %, 体积/体积，乙醇/水），溶剂材料比（X₂, ml/g) 和萃取时间 (X₃，min），以槲皮素和 TF 产量为指标。选择固定的颗粒尺寸（0.45-0.9 mm）。所有运行的槲皮苷和 TF 产量显示在表格1。基于这些结果，使用二阶多项式模型（方程（1））进行多元线性回归。

表格1

可旋转中心复合设计设置，以自变量的原始和编码形式（X₁， X₂， X₃）以及响应变量槲皮苷和 TF 的实验结果

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自变量的方差分析显示在表2 表明所有这三个自变量都显着影响提取效率（磷 < 0.05）。拟合二次模型的回归参数及其对应的多次测定系数（右²）显示在表3。实现了良好的拟合，并且模型解释了响应的可变性。高右² 槲皮苷和 TF 的值分别为 0.94 和 0.96，这意味着实验数据证实了与模型预测的数据的兼容性。变异系数的较低值（槲皮苷为 1.92%，TF 为 3.28%）表明从拟合模型获得的结果是可靠的。调整后的决定系数（右² Adj.) value 重建包含所有*重要术语和高值的表达式右² 调整。（右² 调整。分别等于87%、92%）支持了该模型的重要性。

表2

响应面二次模型的方差分析

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表3

响应变量槲皮素和 TF 的预测二阶模型的回归系数

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失拟检验用于验证模型适合度的充分性。失拟检验的方差分析对于槲皮苷和 TF 产量并不显着（磷 > 0.05)，表明模型能够充分拟合实验数据[表4].

表4

槲皮苷和 TF 失拟检验的方差分析

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响应面分析

自从;模型拟合良好，回归方程充分解释了响应值。绘制响应曲面曲线以展示自变量的相互作用并确定每个自变量的最大响应的最佳值。自变量和因变量之间的关系通过三维 (3D) 响应曲面图和二维 (2D) 等值线图进行说明。 3D 响应面和 2D 等值线图以回归方程的图形表示形式提供 [图 [图77 和和8]。8]。每条轮廓曲线代表两个自变量的无限多个组合，同时将另一个自变量保持在静止点。通过这种方式，可以轻松地可视化 3D 响应面。图7a 显示了由溶剂成分和溶剂材料比模型开发的 3D 响应面函数。溶剂成分表现出对响应的二次影响。当使用65%乙醇时槲皮苷含量达到最高值。类似地，溶剂与材料的比例同时表现出对槲皮苷的二次效应。溶剂组成和溶剂材料比对TF的影响结果显示在图8a。溶剂组成对 60% 和 70% 乙醇之间的最大响应显示出二次效应。类似地，当溶剂组成一定时，随着溶剂与物料比的增加，TF逐渐增加，并在溶剂与物料比约为10:1时达到最高值。

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图7

响应曲面图（a、c 和 e）和等高线图（b、d 和 f）显示溶剂组成 (X1)、溶剂材料比例 (X2) 和萃取时间 (X3) 对槲皮苷产率的影响

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图8

响应曲面图（a、c 和 e）和等高线图（b、d 和 f）显示溶剂组成 (X1)、溶剂材料比例 (X2) 和萃取时间 (X3) 对 TF 产率的影响

自变量溶剂组成和提取时间对槲皮苷和 TF 产量响应值的影响如图所示图7c，7c, ,7d,7天, ,8c,8c, ,8天,8天，分别。通过检查保持另一个自变量溶剂材料比在固定点恒定而生成的等值线图，可以轻松理解两个自变量之间的交互关系[图 [图7d7天和和8d]。8天]。随着溶剂组成和提取时间的增加，槲皮苷和TF的产率显着增加。然而，当自变量超过一定值时，槲皮苷和 TF 产量不再增加。溶剂组成和提取时间的相互作用对槲皮苷产量的影响并不具有统计显着性，但具有显着性（磷 < 0.01) 对 TF 提取的影响。

人物图7e7e 和和8e8e 证明了溶剂-材料比和提取时间对槲皮苷和 TF 产率的影响。随着提取时间和溶剂-材料比的增加，槲皮苷和 TF 的得率增加，这表明槲皮苷和 TF 的提取率与提取时间和溶剂-材料比成正比。从头花中提取槲皮苷和 TF 的两个自变量的交互作用不具有统计学意义。

验证实验

为了验证模型的预测能力，在RSM岭分析得出的优化条件下测试了最佳响应变量。因此，观测值可以在模型预测值的 95% 置信区间内令人满意地实现 [表5].

表5

响应变量槲皮素和 TF 的预测值和观测值之间的比较

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结论

采用一次一因素法结合CCD，对超声辅助提取参数（包括溶剂组成、溶剂与物料比和提取时间）进行了优化，以提取首乌中槲皮苷和TF。结果表明二阶多项式模型对提取数据给出了令人满意的描述。优化条件为：提取方法，超声提取；溶剂，最好用65%乙醇水溶液进行圆整；粒径，0.45-0.9毫米；溶剂与物料的比例，舍入至10:1；提取时间，舍入为 54 分钟。这项研究可以为何首乌的工业提取过程提供基础信息和有价值的见解。

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致谢

作者衷心感谢贵州沃曼药业公司提供原料以及贵州省重大科技专项（2011 6019-02）、贵州省药物分析科技创新人才团队计划（2011 6019-02）的资助。贵州省中药现代化科技产业研究与发展专项（ZY 2011 3013）、中药国药标准化特色重点实验室、贵州省特色重点实验室（2011 4008）省教育厅．（编号：KY 2012 005）。

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脚注

支持来源： 零

利益冲突： 没有宣布。

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