灯盏花素通过调节血清素重塑心肌葡萄糖和脂质代谢以减轻阿霉素引起的心脏毒性

李梦娇, 1 , 2 , † 孙文社, 1 , † 袁阳, 1 , † 张玉坤, 1 , 2 陆奇, 1 , 2 高元珍, 1 , 2 叶婷, 1 , 2 与邢东明通讯作者 1 , 3 ,*

抽象的

目标: 广谱抗癌药物阿霉素(Dox)具有较高的心脏毒性发生率,严重影响该药物的临床应用和患者的生活质量。在这里,我们评估了 Dox 如何调节心肌能量和收缩功能,这可能有助于相关保护药物的开发。

方法: 小鼠接受阿霉素和灯盏花素治疗。通过超声心动图分析心脏功能,并在分离的心肌细胞中评估 Dox 介导的信号传导。在小鼠乳腺肿瘤模型中评估了灯盏花素的双重心脏保护和抗肿瘤作用。

结果: 我们发现Dox通过减少葡萄糖摄取和增加脂肪酸氧化来扰乱心肌能量代谢,导致ATP生成率降低、耗氧率和氧化应激增加,以及进一步的能量不足,从而增强心肌脂肪酸摄取并驱动DIC发展。有趣的是,灯盏花素通过调节血清素-葡萄糖-心肌 PI3K/AKT 环路、增加心脏对葡萄糖的利用并减少脂质氧化,提高 ATP 产生的效率并恢复心肌能量稳态。它增强线粒体自噬 通过 PINK1/Parkin通路,消除Dox引起的受损线粒体堆积,减轻心脏纤维化和炎症程度,恢复心脏微环境稳态。重要的是,其低炎症水平减少了骨髓免疫抑制细胞浸润,这种作用与 Dox 的抗肿瘤作用具有协同作用。

结论: 我们的研究结果表明,Dox 对心脏代谢网络的破坏是其心脏毒性的重要驱动因素,而血清素是心肌葡萄糖和脂质代谢的重要调节剂。心肌能量稳态和受损线粒体的及时清除协同有助于预防蒽环类药物引起的心脏毒性,提高肿瘤治疗的效率。

关键词: 阿霉素、DIC、灯盏花素、血清素、PINK1/Parkin

介绍

蒽环类抗生素阿霉素 (Dox) 是一种高效抗癌药物,用于治疗实体瘤、白血病、淋巴瘤和乳腺癌。)。使用 Dox 可导致进行性、慢性、危及生命的心肌病,称为 Dox 诱发的心肌病 (DIC)。)。值得注意的是,在癌症患者中,因药物相关心脏毒性而死亡的风险超过因肿瘤本身或复发而死亡的风险。)。服用低剂量的 Dox 后可能会发生由心脏毒性引起的 DIC,具体取决于个人的易感性()。流行病学研究表明,肥胖、糖尿病和肝病等代谢异常会导致 DIC 风险增加,而 Dox 会显着降低心脏对葡萄糖的吸收,这表明 Dox 可能通过破坏心脏的葡萄糖吸收来影响 DIC 的发展。心脏的代谢微环境。近年来,DIC潜在分子机制的研究主要集中在红氧稳态失衡、拓扑异构酶IIβ(Top2b)转录抑制、线粒体功能障碍和Ca2+-处理异常()。心脏消耗体内最大的能量,Dox 重塑心脏代谢。然而,驱动 DIC 发展的改变尚不完全清楚。通过调节心脏代谢网络来预防 DIC 的治疗策略尚未建立。

心脏能量代谢涉及复杂的相互作用途径,导致利用每一类能量底物进行 ATP 生产或生物合成。该网络最显着的特征是响应各种刺激而表现出的代谢灵活性,包括发育变化、营养状况、慢性病理生理状况和药物干预。)。线粒体是一种多用途细胞器,占心肌细胞体积的三分之一,不仅产生心脏所利用的超过 95% 的 ATP,还调节细胞内钙稳态、信号转导和细胞死亡,是协调能量的核心转导()。尽管心脏能够利用各种能量底物(包括碳水化合物、脂质、氨基酸和酮体)来产生 ATP,但所使用的底物会影响心脏效率。在肥胖和糖尿病的情况下,脂肪酸浓度和氧化升高与葡萄糖氧化减少有关。)。心脏功能障碍与心肌耗氧量增加、心脏效率降低和氧化应激增加有关,表明脂肪酸氧化(FAO)增加对心脏功能有害。)。高FAO产生不利影响的机制之一是氧效率降低和脂肪酸衍生物水平增加,这可能通过线粒体解偶联进一步降低效率。事实上,在 DIC 中观察到脂质过氧化 (LP) 升高,这表明高FAO可能是心脏损伤的关键途径。因此,我们假设 Dox 治疗期间心脏代谢重塑增加了脂肪酸的摄取和氧化,导致 ATP 生产效率低下,伴随着高耗氧量和氧化应激,而心脏效率的降低反过来又反馈到脂肪酸利用率的增强线粒体损伤,进而加速 DIC 的进展。

有趣的是,流行病学研究表明,经常食用富含类黄酮的食物可能会降低许多心血管疾病的风险,而且许多天然类黄酮化合物已被证明可以保护心脏功能。). 灯盏花,也称为 灯盏花 或罗布麻,是一种传统草药,已有 600 多年的使用历史。 Breviscapine 是一种类黄酮成分 灯盏花 具有广泛的药理作用,如抗氧化、抗炎和抗肿瘤作用()。灯盏花素注射液是我国治疗心脑血管疾病应用最广泛的经典药物,也是我国医院急救的重要药物。灯盏花素应用于临床治疗高血压、脑栓塞、脑血管疾病已有20多年的历史()。但目前尚无其对化疗药物引起的心脏损伤的保护作用的报道。

在本研究中,我们通过利用H9c2大鼠心肌细胞和C57BL/6小鼠建立蒽环类药物诱导的心肌损伤模型,探讨灯盏花素对DIC的潜在影响及其可能的分子机制。我们还系统地阐明了灯盏花素可以通过葡萄糖调节的分支血清素途径提高心肌葡萄糖利用效率,从而发挥胰岛素样功能,在较低耗氧量的情况下实现高ATP生产效率和低氧化应激水平,并能激活经典的线粒体PINK1/Parkin自噬通路消除Dox诱导的受损线粒体堆积,协调氧化应激和能量产生的调节,逐步恢复心脏微环境的稳态。人们认为灯盏花素是一种潜在的新型保护剂,可用于治疗阿霉素引起的心脏毒性。

材料和方法

所有动物研究均经青岛大学动物护理和使用委员会的指导方针批准并进行。

试剂

使用以下试剂:DMEM、FBS、青霉素/链霉素(美仑生物,大连,中国)、cTnI Elisa 试剂盒(生工生物科技,上海,中国)、TNF-α、IL-1β 和 IL-6 Elisa 试剂盒(MyBioSource,美国圣地亚哥)、MDA 试剂盒、SOD 试剂盒、NADH 试剂盒(Solarbio,北京,中国)、CCK-8 试剂盒(碧阳天生物科技,中国上海)、ROS 荧光试剂盒、JC-1 荧光染料、蛋白提取试剂盒,和BCA试剂盒(美伦生物,大连,中国)。 IL-1 (1:100)、PINK1(1:1,000)、Parkin (1:1,000)、AMPK(1:1,000)、Akt (1:1,000)、P13K(1:1,000)、Tom20 (1:1,000) 、β-微管蛋白 (1:1,000)、mTOR (1:1,000) 和 HRP 标记的 GAPDH (1:1,000) 抗体均购自 Abclonal Biotechnology(中国武汉)。 RIPA 裂解缓冲液和上样缓冲液购自美伦生物(中国大连)。 PVDF 膜购自 Merck(美国新泽西州)。 DMSO 购自 Macklin(中国上海),阿霉素、灯盏花素和右雷佐生购自 Widely(中国武汉)。 Mdivi-1 抑制剂购自 Selleck Chemicals(美国休斯顿)。

细胞培养条件和细胞系

用于细胞培养的培养基和补充物购自 Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, United States),塑料器皿购自 Corning (Corning, NY, United States)。 H9c2胚胎大鼠心脏来源的心肌细胞(ATCC,CRL-1446)在含有10%胎牛血清、100单位/ml青霉素G钠和100μg/ml硫酸链霉素的DMEM中培养(37℃,5% CO2)。 MCF-7 人转移性乳腺癌细胞(iCell、iCell-h129)在补充有 10% 胎牛血清、100 单位/ml 青霉素 G 钠和 100 μg/ml 硫酸链霉素的 1,640 培养基中培养。 4T1小鼠乳腺癌细胞(ATCC,FS-0158)在补充有10%胎牛血清、100单位/ml青霉素G钠和100μg/ml硫酸链霉素的DMEM培养基中培养。

当细胞达到 80-90% 汇合时定期传代,并接种于 96 孔板(1 × 104 细胞/孔)。 H9c2 细胞暴露于对照,5 μM Dox(), 5 μM Dox+20 μM Dexra (), 或 5 μM Dox+200 μM 灯盏花素 ()分别为24小时。仅用DMEM处理的细胞作为空白对照,Dexra作为阳性对照。最后,我们还注射了 Mdivi-1(5μM,溶于 DMSO),一种线粒体分裂抑制剂().

氧化应激评估

根据制造商的说明,使用荧光染料 DCFH-DA 测量细胞内 ROS 水平。简而言之,在 PBS 中制备 DCFH-DA 溶液 (1 μM),并将其添加到在 6 孔板中培养的 H9c2 细胞中,然后在 37°C 下孵育 30 分钟。孵育后,用PBS洗涤细胞。使用 Leica Microsystems, Ltd. 的荧光显微镜以 20 倍放大倍数拍摄荧光显微照片。使用 Beckman 流式细胞仪(美国加利福尼亚州贝克曼)对 ROS 水平进行定量。

酶学指标的测定

SOD 和 NADH 的活性根据制造商的说明使用活性测定试剂盒进行测量。使用酶标仪(Perkin Elmer,马萨诸塞州,美国)测量吸光度和发光度。

电子显微镜

将细胞用 0.5% 戊二醛固定剂在 4 °C 下固定 15-30 分钟,然后以 10,000-13,000 rpm 离心 5 分钟收集细胞。将细胞进一步用3%戊二醛在4℃下固定过夜,然后用1%四氧化锇在室温下处理2小时。此后,将样品在丙酮梯度中脱水,包埋在Epon 812中,进行光学定位,并切成超薄切片。将切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅进行双重染色。使用 H-7650 透射电子显微镜(日本东京日立公司)检查线粒体超微结构。

线粒体呼吸的测定

约106 使用 O2K 呼吸计(Oroboros Instruments,奥地利)测量细胞的线粒体呼吸。使用Oroboros DatLab 7.4软件测定和分析氧浓度。简而言之,仅记录细胞中的泄漏呼吸状态,通过添加 5 mM ADP 将电子转移与磷酸化偶联,并记录复合物 I 支持的状态 3 呼吸。通过添加 10 mM 琥珀酸盐记录来自复合物 I 和复合物 II 的平行电子输入的最大态 3 呼吸,并在 6.25 µM 鱼藤酮存在下测量复合物 II 支持的呼吸。在 5 µM 羰基氰化物对(三氟甲氧基)苯基腙 (FCCP) 存在下记录最大电子转移容量。最后,给予抗霉素(Ama),其完成复合体Ⅲ并阻断所有电子传递,并测量耗氧率作为非线粒体耗氧量。

线粒体膜电位变化的测定 (ΔΨm)

使用 5.5',6.6'-四氯-1.1',3.3'-四乙基苯并咪唑基碘化碳花青 (JC-1) 染色来评估 H9c2 细胞中的线粒体膜电位。简而言之,根据预定的实验条件,用温热的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤H9c2细胞,然后用100μL 2μM JC-1溶液(在不含酚红的DMEM中混合)染色并在标准细胞培养物下孵育条件下在黑暗中放置 30 分钟。孵育后,用温热的 DPBS 洗涤细胞,并使用 Leica Microsystems CMS GmbH 倒置荧光显微镜(Leica Camera AG,Barnack,德国)在 20 倍放大倍数下拍摄荧光显微照片。

免疫荧光

为了评估线粒体定位,用冷 PBS 清洗盖玻片上生长的细胞,并用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。然后,用0.5% Triton X-100透化细胞20分钟,并用5%山羊血清封闭30分钟。将细胞与一抗在 4°C 孵育过夜,并与二抗孵育 1 小时。洗涤3次后,用4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞进行染色,并用共焦激光扫描显微镜成像。

ATP测量

此外,按照制造商的方案使用 ATP 测定试剂盒测量细胞内 ATP 浓度。通过重复移液将细胞在裂解缓冲液中裂解,并在 4°C 和 13,000 g 下离心 10 分钟。上清液用于分析 ATP 水平,并通过 BCA 测定测定蛋白质浓度。将50微升上清液加入100μl ATP检测液中,室温孵育5min,立即混匀,用光度计(Flex Station 3)测定发光。根据标准曲线计算ATP浓度并换算成nmol/μg蛋白质。

蛋白质印迹法

通过蛋白质印迹评估蛋白质表达并通过光密度测定法定量。使用 RIPA 裂解缓冲液裂解 10 cm 细胞培养皿中的 Dox 和 Dox + Brev 处理的 H9c2 细胞。取 5 mg 组织,加入 10 ml 裂解缓冲液。 Bradford法用于测量蛋白质浓度,以BSA为标准。将等量的蛋白质与上样缓冲液 (5X) 混合,并在 95°C 下煮沸 5 分钟。然后通过 10%–12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (SDS-PAGE) 电泳解析蛋白质并转移到 PVDF 膜上。用 TBST 中的 5% 牛奶在室温下封闭 2 小时后,将膜与特异性抗体(例如兔多克隆 GAPDH)在 4°C 下孵育过夜。使用针对 AMPK、Parkin、PINK1、Akt、PI3K、Tom20 的抗体对蛋白质表达和磷酸化进行 WB 分析,并使用 GAPDH 作为内部对照。使用 Bio-Rad 凝胶文档系统(Bio-Rad Laboratories,加利福尼亚州,美国)对特定信号进行可视化。数据表示为平均值±SD(n = 3) 并通过 ImageJ 分析进行量化。

畜牧业

实验使用八周龄雌性 C57BL/6 小鼠(中国北京四培福)。将动物饲养在笼子中,并在 50% 湿度和 25°C ± 2°C 下进行 12 小时光照/12 小时黑暗循环。动物可以自由获取标准颗粒饲料和水。通过在 4°C 下以 200 g 离心 10 分钟获得血浆,并在提取前保持在 -80°C。

调查符合 实验动物护理和使用指南 由美国国立卫生研究院出版(NIH 出版物第 85-23 号,1985 年修订)。

动物实验方案

将小鼠随机分为6个治疗组,包括对照组、模型组(Dox组)、三剂量Dox+Brev组和Dox+Dexra组。

为了模仿人类治疗方案,施用累积剂量为 12 mg/kg 的 Dox 通过 除对照组外,每周 3 次 ip 注射(第 0、7 和 14 天 4 mg/kg)。

研究 Brev 的效果 体内, 小鼠接受Brev治疗,随后每日腹腔注射4.8和16 mg/kg的Brev,持续3周;Dox + Dexra治疗组的小鼠除Dox外还接受腹腔注射12 mg/kg Dexra,持续3周。治疗。 ()。 Brev 和 Dexra 在注射 Dox 后接受治疗。首次注射 Dox 后 3 周,每日监测存活率并通过超声心动图评估心脏功能().

对照组注射等体积的生理盐水。施用 Dox 后 1 周处死小鼠。

肿瘤研究

小鼠皮下注射1×105 4T1乳腺肿瘤细胞。细胞注射一周后,当肿瘤的平均直径大于2毫米时,如前所述用Dox或灯盏花素治疗小鼠。每周测量两次肿瘤大小,持续长达 4 周,并使用以下公式计算肿瘤体积:V = 4π/3×(L/2)2×(W/2),其中 V、L 和 W 代表分别是肿瘤的体积、长度和宽度。

18F-氟脱氧葡萄糖 PET/CT 成像

Dox 和灯盏花素组小鼠(禁食过夜)用 2% 异氟烷麻醉,并注射 ∼11MBq/0.2 ml 氟脱氧葡萄糖 (FDG) PET 通过 尾静脉,然后返回笼子。四十分钟后,再次用 2% 异氟烷麻醉小鼠,并将其放置在 microPET Focus 220(德国柏林西门子公司)的立体定向床上。然后开始 20 分钟静态 PET 扫描。随后,小鼠在 microCAT II(西门子公司,柏林,德国)中以 180mAs 的 X 射线束强度和 80 kVp 的 X 射线管电压对小鼠进行成像,以便与 PET 图像进行解剖学共同配准。

患者

禁食4小时以上并确保血糖水平低于120 mg/dl后,所有患者均接受静脉注射 18F-FDG (5.5 MBq/kg)。注射后 60 分钟开始使用组合 PET/CT 传记仪(德国柏林西门子公司)进行 PET/CT 扫描。所有扫描均在三维模型中进行。首先进行低剂量 CT 扫描以进行衰减校正和解剖相关性。伦理审查符合青岛大学附属医院公布的《伦理委员会审批文件指南》(QDU-HEC-2022057)。

心功能和组织病理学分析

将各组小鼠心脏组织保存于4%多聚甲醛中,包埋于石蜡中,连续切成4mm切片。组织切片脱蜡 通过 浸泡在二甲苯中(3次,每次5分钟),并使用递减系列的醇(100%、90%、85%和75%酒精,每次5分钟)再水化。将切片用苏木精和曙红染色用于组织学分析。使用马森三色染色剂对活检样本进行染色,以研究心脏的任何形态和纤维化变化。蓝色染色代表胶原蛋白积累。根据制造商的说明,使用 Histone Simple 染色试剂盒(Nichirei,Tokyo,Japan)进行免疫组织化学。将切片用甲醇中的 3% H2O2 处理 15 分钟以灭活内源过氧化物酶,然后与一抗 IL-1(1:100)在室温下孵育 1 小时。然后使用 Leica Microsystems 的 CMS GmbH 倒置荧光显微镜(Leica Camera AG,Barnack,德国)在 20 倍放大倍数下观察超微结构。

血糖水平的测量

小鼠维持正常饮食。实验当天,小鼠禁食6小时(上午8点开始),并采血 通过 尾静脉用于测量葡萄糖水平。

H9c2大鼠心肌细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并离心并超声破碎,并在标准细胞培养条件下孵育10分钟。孵育后,使用酶标仪(Perkin Elmer,马萨诸塞州,美国)测量吸光度。

酶联免疫吸附测定

用裂解缓冲液裂解小鼠组织。使用 Qsonica 匀浆器使用 30 Hz 脉冲对样品进行超声处理 20 秒,然后以 12,000 g 离心 10 分钟。收集上清液,等分至 200 µl 小瓶中,并保存在 -80°C 下。通过 BCA 测定对样品的蛋白质浓度进行定量。根据制造商的方案,使用酶联免疫吸附测定试剂盒对样品进行 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 分析。使用 VICTOR Nivo™ 酶标仪(Perkin Elmer,马萨诸塞州,美国)在 450 nm 处测量光密度。

小鼠代谢组变化的测定

血样重悬,冰上孵育,离心,稀释至终浓度,离心。最后,将上清液注入LC-MS/MS系统进行分析。使用 Vanquish UHPLC 系统(Thermo Fisher,马萨诸塞州,美国)和 Orbitrap Q Exactive 进行 UHPLC-MS/MS 分析TM值 HF 质谱仪(Thermo Fisher,马萨诸塞州,美国)。使用 KEGG 数据库、HMDB 数据库和 LIPID Maps 数据库对鉴定的代谢物进行注释。使用metaX进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。我们应用单变量分析(t-test)计算统计显着性(p-价值)。 VIP>1 的代谢物, p 值<0.05,倍数变化≥2或≤0.5被认为是差异丰度代谢物。

统计分析

使用 ANOVA 和 IBM SPSS Statistics(V19.0,美国)进行统计分析。数据表示为平均值±SD(n = 6–9)。 p < 0.05 被认为是显着的。

结果

蒽环类药物降低心肌葡萄糖代谢并增加脂肪酸利用率

我们首先研究的是 18接受蒽环类化疗患者和未接受化疗患者心脏的 18F-FDG PET/CT 图像,数据分析显示(图1A)接受化疗的患者心肌葡萄糖摄取呈减少趋势。我们预测该参数的变化可能与蒽环类药物引起的心脏毒性有关。为了验证代谢异常与 DIC 之间的内在联系,我们建立了 Dox 诱导的 DIC 小鼠模型,并 18F-FDG PET 结果显示,4 周后,Dox 治疗小鼠的心脏摄取量显着低于未治疗小鼠(图1B)。这表明蒽环类药物影响患者和小鼠模型的心肌葡萄糖代谢。

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(A) 浓度 18接受化疗和未接受化疗的患者的心脏吸收 F-FDG。 (二) 18F-FDG PET/CT 图像采集和心脏 18F-FDG 吸收。 (C) Dox 治疗小鼠的热图。 (四) H9c2细胞中的MDA含量。 (五) HE 染色显示 Dox 减少了心肌细胞的大小。对照与 Dox:***p < 0.0005,**p < 0.005,*p < 0.05,平均值±SD。 n = 6–9。

正常情况下,心肌主要利用糖类和脂类供能,糖类和脂类分别约占心肌能量的20%~30%和60%;此外,葡萄糖能更有效地产生 ATP()。心脏如何适应化疗干预对心肌能量代谢的重塑,以及这种改变是否影响心脏稳态并导致 DIC 的发展尚不清楚。通过分析小鼠的代谢组数据(图1C),我们发现Dox暴露后水平升高的代谢物主要涉及脂质分类,D-葡萄糖-6-磷酸和AKG等糖代谢指标水平下降明显。此外,KEGG 富集分析显示,Dox 暴露后脂质代谢途径发生显着改变(补充图S1)。心肌中FAO代谢物MDA的水平(图1D)在 Dox 治疗后显着升高。这表明,Dox 干预后,心脏的葡萄糖代谢受损,取而代之的是脂质燃烧增加,而脂质燃烧的能量效率相对较低。这种脂质代谢不足导致心肌中积聚大量脂质,病理染色显示Dox暴露动物心脏中出现大量脂质空泡,导致心脏脂肪变性。图1E).

蒽环类药物会增加心肌耗氧量并降低 ATP 生成率

有趣的是,这种代谢补偿增加了心肌 ROS 水平,导致更高的氧化应激(图2A)。 O2K能量代谢分析表明Dox增加心肌耗氧量(图2B)并导致线粒体膜超极化(图2C)(这也是线粒体氧化应激水平升高的标志,常见于心脏缺血再灌注模型中)。 JC-1 染色还表明,Dox 暴露导致一些存活细胞的膜电位增加(红色荧光强度增强)。图2D)。尽管心脏中发生了耗氧量增加和脂质氧化等代偿过程,但不幸的是,由于葡萄糖代谢的减少,心肌中的 ATP 生成率急剧下降。图2E)。耗氧率和ATP生成率的比较表明,Dox暴露导致心肌消耗大量氧气,但只产生少量ATP(图2F),大大增加了心脏的负担。这种能量输出的不足导致 Dox 组中能量受体 AMPK 水平显着增加(图2G)。因此,我们假设心脏因蒽环类药物引起的葡萄糖代谢受损而表现出高耗氧率和低ATP生成率,这种现象不能完全满足心肌的能量需求,而是导致过度的氧化应激。因此推测,响应能量缺口,心脏中的脂质氧化增加,更多的ROS积累,这种不良的反馈途径可能是DIC的重要驱动因素。

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(A) H9c2 细胞中 ROS 染色的强度。 (二) H9c2 细胞的心脏耗氧量。 (C) 线粒体膜电位。 (四) JC-1 染色和条形图。 (五) H9c2 细胞中的 ATP 含量。 (F) H9c2 细胞中 ATP 产量/耗氧量之比。 (G) 测定AMPK和β-微管蛋白的表达水平 体外 由世界银行。对照与 Dox:***p < 0.0005,**p < 0.005,*p < 0.05,平均值±SD。 n = 6–9。

新型心脏保护剂灯盏花素促进心脏葡萄糖代谢并抑制Dox诱导的心肌病

受上述结果的启发,我们从代谢角度研究了用于治疗心血管疾病的黄酮类灯盏花素对 DIC 进展的保护作用。实验方案如图所示 图3A, 和 18首次注射阿霉素 1 周后,对小鼠进行 18F-FDG PET/CT 成像。如图所示 图3B灯盏花素治疗组的心脏摄取显着高于单独的 Dox 治疗组,表明灯盏花素干预可以逆转 Dox 诱导的心脏葡萄糖代谢下降并重塑心脏能量代谢。接下来检查灯盏花素治疗后的心功能和病理变化,并以临床药物右雷佐生(Dexra)作为阳性对照。超声心动图在 图3C 结果显示,Dox组的LVEF和LVFS显着低于对照组,LVESV和LVD显着高于对照组。这些结果表明,Dox治疗后小鼠左心室收缩功能下降,本研究中Dox引起的心肌损伤与扩张型心肌病相似。 Dox 降低了收缩功能,这与之前报道的类似()。与仅用阿霉素治疗的动物相比,用 Brev 和 Dox 治疗的动物心脏的所有功能均得到恢复。 cTnI 是心肌损伤的生物标志物()。与对照组相比,单独使用阿霉素治疗的小鼠cTnI浓度显着升高,并且不同浓度的Brev显示出更好的效果(图3D)。而且,不同处理后的病理心脏组织染色显示,对照组小鼠的心脏组织结构正常。与对照组不同,Dox组小鼠表现出大量心脏病变,包括坏死、细胞内水肿、肌原纤维紊乱和断裂以及心肌纤维波状变性。有趣的是,灯盏花素预处理可以预防这种类型的损伤,减轻心脏脂质的过度积累,并恢复心肌稳态。图3F)。心肌Masson染色显示,Dox治疗后间质纤维化明显增加,Brev干预降低了心肌纤维化程度。图3E)。心脏超声数据显示,Dox 组的 LVESV 和 LVID 显着高于对照组,表明心室腔直径扩大,而灯盏花素治疗可以显着缓解这些变化。这些结果表明灯盏花素可以重塑心脏代谢,增加心脏葡萄糖摄取,减少心脏脂肪变性,减轻阿霉素引起的心脏功能障碍和心肌形态变化。

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(A) 小鼠治疗方案示意图。 (二) 18在第一次 Dox 暴露 1 周后,使用小鼠进行 18F-FDG PET/CT 成像,并测量心脏吸收的 18F-FDG 浓度。 (C) 超声心动图显示灯盏花素可防止 Dox 引起的左心室扩张。代表性 M 型短轴超声心动图显示 Dox 诱导左心室扩张,并且灯盏花素在 Dox + Brev 组中发挥保护作用。用灯盏花素治疗的小鼠舒张期的 EF 和 FS 显着低于用 Dox 治疗的小鼠,而 HR 显着较高。 (四) 灯盏花素降低 cTnI 的浓度。 (五) Masson染色显示灯盏花素可降低Dox诱导的心脏纤维化程度。 (F) HE 染色显示灯盏花素可以防止心脏中 Dox 引起的心肌细胞大小减少。对照对比 Dox、4 mg/kg、8 mg/kg 或 16 mg/kg Brev 对比 Dox 以及 Dexra 对比 Dox:***p < 0.0005,**p < 0.005,*p < 0.05,平均值±SD。 n = 6–9。

灯盏花素通过调节外周血清水平和心肌 AKT 表达来重塑心脏葡萄糖和脂质代谢

接下来,我们研究了灯盏花素如何调节糖和脂肪代谢的平衡。如图所示 图4E与Dox处理小鼠相比,灯盏花素治疗小鼠外周血清中血清素水平显着升高,且降低程度与灯盏花素剂量呈线性关系,降低幅度超过95%在高剂量组中观察到。血清素 (5-HT) 是一种单胺,在神经元和非神经元系统中具有多种功能。)。在中枢神经系统中,5-HT 充当调节情绪和进食行为的神经递质()。最近的研究表明,外周5-HT通过抑制棕色脂肪组织的适应性生热作用,在外周组织的代谢调节中发挥重要作用。在饮食诱导的肥胖小鼠模型中,抑制 5-HT 合成可减少体重增加并改善代谢功能障碍()。全基因组关联研究还揭示了血清素系统与肥胖之间的遗传联系。血清素对葡萄糖代谢有两种不同的作用:它直接诱导胰腺B细胞分泌胰岛素,降低血糖水平;它会抑制肝脏和骨骼肌以外的组织从血液中摄取葡萄糖,从而提高血糖水平。)。研究表明,血清素治疗可导致血糖水平突然大幅升高,但血清素如何抑制组织从血液中摄取葡萄糖仍不清楚。我们的实验结果表明,灯盏花素治疗后,外周血清素水平急剧下降,对应于心脏葡萄糖摄入量的增加(图4E),而肝脏葡萄糖摄入量没有显着变化(补充图S2)和空腹血糖(FBG)水平降低(图4A)。在灯盏花素组中,额外补充 5-HT 会增加小鼠的血清素水平并减少心脏葡萄糖摄取。图4B)。为了进一步分析血清素如何调节心肌细胞代谢,我们在Dox诱导的心肌损伤模型小鼠中添加额外的5-HT以增加血清素水平,然后收集小鼠的心脏进行转录组分析。结果表明,Dox 和 5-HT 治疗组的脂肪酸氧化明显高于单独使用 Dox 的组(补充图S3)。然后我们分析了 PI3K 蛋白激酶 B (Akt/PKB) 通路的变化,该通路是心肌葡萄糖代谢的重要调节因子,在调节葡萄糖摄取中发挥重要作用;促进细胞分裂、增殖和存活;并抑制细胞凋亡。结果表明,5-HT的添加直接抑制Akt基因表达,但没有显着改变PI3K催化亚基或调节亚基水平(图4C)。 AKT 缺失会降低心肌细胞代谢葡萄糖的能力。这些结果表明,灯盏花素通过显着降低血清素水平,解除血清素对组织葡萄糖摄取的抑制作用,保证病理状态下血液中葡萄糖的吸收,揭示了机体可能参与心脏代谢调节的可能性。通过神经递质进行重塑。更重要的是,灯盏花素作为我国常用的心血管药物,可降低外周血清素水平90%以上,在治疗心肌糖代谢所致的心肌肥厚和心力衰竭方面比经典的血清素再摄取抑制剂氟西汀具有更强劲的效果。疾病和糖尿病,代表了治疗阿霉素引起的心脏毒性的一种新的安全药物。流行病学研究还表明,糖尿病会增加阿霉素引起的心脏毒性的风险;因此,这项研究为糖尿病和癌症患者提供了一种潜在的治疗策略().

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(A) 小鼠的空腹血糖水平。 (二) 浓度 18补充 5-HT 后,F-FDG 被心脏吸收。 (C) 补充 5-HT 后转录组分析的热图。 (四) 检测PI3K、Akt、GAPDH的表达水平 体外 由世界银行。 (五) 小鼠外周血清中的血清素水平。 (F) 小鼠体内 D-葡萄糖 6-磷酸水平。 (G) 小鼠体内α-酮戊二酸的水平。对照与 Dox、4 mg/kg、8 mg/kg 或 16 mg/kg Brev 与 Dox 以及 Brev+5-HT 与 Brev:***p < 0.0005,**p < 0.005,*p < 0.05,平均值±SD。 n = 6–9。

基于这些发现,我们研究了灯盏花素如何调节血糖。随心所用。结果显示,灯盏花素干预后,Dox暴露小鼠体内PI3K蛋白表达显着降低,心脏组织中PI3K蛋白表达水平显着升高。有趣的是,在对照组和 Dox 暴露组中,AKT 表达均维持在较低水平,并且在灯盏花素治疗后观察到 AKT 表达显着增加(图4D)。先前的研究表明 AKT 刺激细胞中的葡萄糖代谢,将葡萄糖转化为 D-葡萄糖 6-磷酸 通过 己糖激酶用于糖酵解或聚合成糖原。我们的结果表明,灯盏花素促进心肌AKT表达后,糖代谢相关的D-葡萄糖6-磷酸和α-酮戊二酸水平显着升高(图4F,G),表明灯盏花素通过AKT增强心肌利用葡萄糖作为能量来源的能力,促进葡萄糖分解代谢。既往研究报道,PI3K-Akt表达增加可以促进外周组织糖利用,降低胰岛素抵抗,增强心脏能量供应,预防心功能不全,而PI3K-Akt通路的抑制则影响心肌细胞的生理活动。)。这些结果表明灯盏花素通过调节 PI3K-Akt 通路的激活来增强对 Dox 诱导的心肌损伤的抵抗力。这些结果表明灯盏花素通过抑制血清素调节血糖水平,阻断心肌葡萄糖利用的限制,并通过激活PI3K-Akt途径促进心肌葡萄糖代谢。因此,5-羟色胺可能是调节心脏糖脂代谢的重要靶点。然后,我们分析了心肌糖脂代谢重塑后心脏功能和稳态的变化。与Dox模型组相比,灯盏花素治疗组心肌ATP生成显着增加(图5A),而ROS和FAO代谢物MDA的水平显着降低(图5B、E)。 O2K能量代谢分析表明,灯盏花素可抑制Dox暴露引起的心脏耗氧量的急剧增加(图5C),显着降低了 ATP 产量/耗氧量比率(图5D),并将线粒体膜电位标准化(补充图S4)。这表明灯盏花素治疗增加了心肌使用高能效率葡萄糖作为能源的能力;提高ATP生产效率;并减少心脏负荷、氧化应激和心肌耗氧量。综上所述,灯盏花素可通过调节血清素-血糖-心肌AKT环路,重塑心肌能量代谢,增加葡萄糖利用率,降低FAO,有效打破Dox暴露引起的心脏高耗氧率和脂质燃烧不充分的恶性循环。 (图5F),阻止DIC的进一步发展。

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(A) H9c2 细胞中的 ATP 含量。 (二) H9c2细胞中的MDA含量。 (C) H9c2 细胞的心脏耗氧量。 (四) H9c2 细胞中 ATP 产量/耗氧量之比。 (五) H9c2 细胞中 ROS 染色的强度。 (F) 原理图,示意图。 Control 与 Dox、Brev 与 Dox 以及 Dexra 与 Dox:***p < 0.0005,**p < 0.005,*p < 0.05,平均值±SD。 n = 6–9。

灯盏花素通过 PINK1/Parkin 信号通路清除 Dox 治疗后的线粒体损伤并恢复心肌稳态

尽管在过去几十年中关于 DIC 机制的假设有所不同,但 DIC 的关键特征是氧化还原失衡和线粒体功能受损。该结果阻止了之前从心脏能量比和能量输出效率角度改进DIC发展的假设,但提出了一个关键问题,即灯盏花素如何通过优化线粒体后心脏内的代谢网络来实现高效的能量产生和心脏微环境稳态。受伤。因此,我们旨在回答这个问题。 Pten诱导的推定激酶1 PINK1/Parkin信号通路是线粒体自噬介导的主要通路之一,在维持心肌细胞的能量代谢中发挥着重要作用。)。当心肌细胞内的线粒体受损时,PINK1作为线粒体质控系统的“哨兵”,会在线粒体外膜聚集,聚集并磷酸化Parkin。)。激活的 Parkin 泛素化受损的线粒体,然后与溶酶体融合以完成降解。 PINK1/Parkin 信号通路介导的线粒体自噬增强可以维持心肌细胞中的线粒体稳态并减缓心脏病的进展。).

因此,我们推测灯盏花素通过PINK1/Parkin通路增强线粒体自噬,维持心肌细胞线粒体稳态。 WB显示,与Dox组相比,灯盏花素治疗组PINK1/Parkin总蛋白表达水平显着升高(图6A),相应的磷酸化水平也显着升高(图6B)。 Dox治疗组中PINK1/Parkin蛋白表达呈下降趋势,蛋白磷酸化显着降低,而线粒体膜蛋白Tom20水平升高,提示Dox虽然诱导线粒体损伤,但抑制了受损细胞的及时清除。线粒体。在 Dox 组中观察到大量断裂和受损的线粒体(红色箭头, 图6D),而在 Brev 组中观察到大量溶酶体包裹的线粒体自噬(蓝色箭头)。同时应用Dox和Brev时,线粒体嵴明显,线粒体形态正常,膜结构完整。用 MitoTracker 染色后,发现 Dox 组的荧光强度最高(图6C),表明 Dox 组的线粒体明显多于对照组和 Brev 组。此外,Brev 治疗后抗氧化蛋白 NADH 和 SOD 的水平显着增加(补充图S5)。与 Dox 组相比,Brev 治疗组能量受体 AMPK 的磷酸化显着降低,同时细胞生长控制中心被激活(图6E)。这些结果表明,Dox暴露会导致心肌损伤、线粒体积累和体内平衡失衡,这在一定程度上解释了为什么Dox给药后心脏能量输出效率降低、氧化应激增加。灯盏花素可促进线粒体自噬,清除受损线粒体,恢复心肌稳态,有效保证心脏ATP生成与氧化应激之间的动态平衡。

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(A) 测量 PINK1、Parkin、Tom20 和 GAPDH 的表达水平 体外 由世界银行。 (二) 评估了 p-PINK1、p-Parkin 和 Tom20 的表达水平。 (C) 线粒体示踪染色。 (四) 电子显微镜。 (五) 评估了 p-AMPK、p-mTOR、p-Akt 和 p-PI3K 的表达水平。 (F) 补充 Mdivi-1 后 H9c2 细胞中 ROS 染色的强度。 (G) 补充 Mdivi-1 后 H9c2 细胞中的 ATP 含量。(H) p-AMPK/t-AMPK、p-mTOR/t-mTOR、p-Akt/t-Akt 和 p-PI3K/t-PI3K 的条形图。对照与 Dox、Dox + Mdivi-1 与 Dox、以及 Dox + Brev + Mdivi-1 与 Dox + Brev:***p < 0.0005,**p < 0.005,*p < 0.05,平均值±SD。 n = 6–9。

当灯盏花素的这种作用被 Mdivi-1 阻断时,心肌细胞中的 ROS 水平显着增加(图6F),而 ATP 产量显着下降(图6G)。此外,心肌细胞的存活率降低(补充图S6),并且灯盏花素对心肌细胞的修复作用受到抑制。当Dox与Mdivi-1联用时,心肌细胞ATP生成和存活率进一步降低,ROS水平升高,心肌损伤加剧。这些结果表明线粒体自噬在 Dox 诱导的心肌细胞损伤中起着关键作用。单纯心脏代谢网络重塑并不能完全抵消线粒体损伤引起的功能障碍,灯盏花素的心肌保护作用依赖于糖脂代谢的调节和线粒体自噬的激活。这也可能是DIC发展假说中没有考虑心脏代谢网络调节的原因。建议在治疗Dox引起的心功能不全和心力衰竭症状时,预防疾病进展和恢复心功能同等重要,这更有利于患者的预后和生活质量。

灯盏花素与乳腺癌化疗具有协同作用,可减轻 Dox 给药后的炎症并减少免疫抑制细胞浸润

根据线粒体起源理论,线粒体来源于需氧菌的融合,也就是说线粒体具有外来特性()。当线粒体受损时,损伤相关分子模式 (DAMP) 就会被触发,从而激活人体的免疫反应。)。因此,我们假设灯盏花素促进受损线粒体的清除并有助于减少炎症。结果显示,灯盏花素干预后血清中炎性细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平显着降低。图7A),心脏组织的免疫染色显示 IL-1β 低水平表达(补充图S7)。这些结果表明灯盏花素可以减少炎症因子的分泌,减轻Dox暴露小鼠的炎症反应。炎症调节因子和效应细胞是肿瘤微环境的重要组成部分,在炎症与肿瘤的关系中发挥着重要作用。)。肿瘤微环境中的炎症具有多种促肿瘤作用,可促进恶性细胞的增殖和存活、血管生成和转移;削弱人体的获得性免疫反应;并改变身体对激素和化疗药物的反应()。灯盏花素减少 Dox 治疗后的炎症,但不影响 Dox 对乳腺癌细胞的杀伤作用 体外 (图7B)。它是否有助于阻止炎症细胞向肿瘤病灶迁移,特别是在肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的协同治疗中,目前尚不清楚。 TAM 是重要的浸润性免疫细胞,可以解释乳腺癌中肿瘤细胞的 50%。小鼠和人类肿瘤中的 TAM 和相关细胞通常是 M2 巨噬细胞,它们具有促进肿瘤生长和血管生成、增强治疗抵抗力并抑制获得性免疫的作用。)。减少 TAM 浸润或药物诱导的 TAM 清除是肿瘤免疫治疗的新兴策略。因此,我们构建了4T1乳腺癌小鼠模型(图7C)。患有 4T1 肿瘤的小鼠 就地 (200毫米3)被随机分为3组(n = 5) 并注射磷酸盐缓冲盐水 (PBS)、Dox 或 Dox + Brev。 Dox 和 Brev 的给药剂量为 10 mgkg−1 体重1.4mgkg−1 分别为体重。治疗后7天处死小鼠,收集肿瘤用于FCM和组织学评估。 Dox + Brev 治疗后,浸润肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 的比例减少了(图7D)。肿瘤组织的组织学染色显示 M2 表型标记物 CD206 的表达显着降低(图7E)。使用 Dox + Brev 治疗的小鼠的肿瘤体积显着低于仅使用 Dox 治疗的小鼠(图7F),表明灯盏花素可以通过减少炎症和 TAM 浸润来抑制肿瘤生长。

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(A) 炎症细胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的血清水平。 (二) MCF-7 细胞活力 体外(C) 治疗患有肿瘤的小鼠的示意图。 (四) 收集小鼠肿瘤用于 FCM。 (五) M2 表型标记 CD206 的肿瘤组织学染色。 (F) 总肿瘤负荷的平均值。 *p < 0.0005。 Control 与 Dox、Dexra 与 Dox 以及 Brev 与 Dox 对比:***p < 0.0005,**p < 0.005,*p < 0.05,平均值±SD。 n = 6–9。

 

讨论

本研究揭示糖脂代谢功能障碍是蒽环类药物引起心脏毒性的重要驱动力,恢复心脏代谢、促进心肌糖代谢、提高心肌能量输出效率是预防Dox心脏副作用的有效方法。它们可以促进线粒体自噬,清除受损的线粒体。减少炎症可增强 Dox 的抗癌作用。

哺乳动物心脏使用大量能量进行持续收缩,ATP 产生和心脏收缩之间的紧密耦合对于正常的心脏功能至关重要。)。这个过程需要心脏能量代谢网络的精确调节。该网络最显着的特点是其对各种刺激的代谢灵活性,包括发育变化和营养状况,以及心脏在慢性病理生理条件下重塑代谢途径以调节心肌能量和收缩功能的能力。)。这种代谢重塑有助于保护心脏功能或加速疾病的进展。关于心脏疾病的研究很多,如心脏肥大、心力衰竭等,但对DIC的研究却很少。先前的研究重点是 ROS 产生和拓扑异构酶 II-β 靶向,这会导致 DNA 损伤、线粒体功能障碍和 Ca2+ 处理不当。然而,清除 ROS 的铁螯合剂和拓扑异构酶 II-β 调节剂 dexra 未能提供显着的益处,这表明还涉及其他因素。 Dox如何调节心肌代谢网络、该代谢网络的重塑如何影响心脏的能量输出效率以及Dox是否会促进心脏毒性仍然未知。最近的研究表明,脂质过氧化积累引起的心肌细胞铁死亡在DIC的进展中起着重要作用,表明Dox暴露的心肌细胞有增强脂质代谢的倾向。)。我们的研究结果进一步阐明,Dox 诱导的心脏毒性是由葡萄糖和脂质代谢失调的恶性反馈循环驱动的,从而导致耗氧量增加、能量产生效率低下和氧化应激水平增加。

灯盏花素是我国治疗心脑血管疾病应用最广泛的经典药物,被列入《中国药典》和国家基本药物目录,是我国医院急救的基本药物。我们的研究发现灯盏花素通过调节血清素-血糖-心肌 AKT 回路、重塑心肌能量代谢、增加葡萄糖利用率和减少脂质氧化来提高 ATP 产生效率。缓解因Dox暴露导致心脏大量脂质代谢不充分而造成的低ATP产生、高耗氧量和高氧化应激的影响,降低AMPK的表达,阻断心脏过度脂质摄取的恶性循环。心肌,并减缓 DIC 的发展()。此外,我们的结果表明,血清素可能作为胰岛素的补充分支来调节血糖,在病理条件下为心脏和其他重要器官提供血糖。血清素对血糖调节具有矛盾的作用。一方面,它与胰岛素相互作用,降低血糖水平;另一方面,它会导致肝脏和骨骼肌以外的组织吸收葡萄糖并提高血糖水平。这表明降低外周血清水平(例如通过灯盏花素治疗)可能有助于器官利用葡萄糖。此外,灯盏花素对心脏毒性的抑制作用依赖于线粒体自噬的增强,在Dox引起的心脏损伤中,单独的心脏代谢重塑并不能导致积累的线粒体的清除。灯盏花素诱导自噬 体内 通过PINK1/Parkin通路恢复心肌线粒体稳态,减轻阿霉素引起的心脏毒性。考虑到自噬的激活参与多种疾病的发生和发展,灯盏花素可能成为线粒体自噬相关疾病的候选药物,具有很好的临床应用价值。最近的研究表明灯盏花素对肿瘤的生长和肿瘤细胞的生物学行为具有一定的抑制作用。)。该研究结果表明,灯盏花素可以预防乳腺癌肿瘤模型中阿霉素引起的心功能障碍,并通过消除受损的线粒体来降低炎症因子水平和免疫抑制巨噬细胞浸润,与阿霉素的抗肿瘤作用具有协同作用。灯盏花素通过提供癌症的双重治疗优势来减少肿瘤生长,防止蒽环类药物的心脏毒性。灯盏花素可预防蒽环类药物引起的心脏毒性,并与蒽环类药物发挥协同抗肿瘤作用,具有良好的临床应用价值。

 

致谢

作者感谢中国青岛大学附属医院癌症研究所 W-SS 的原始草案准备和数据管理。

 

数据可用性声明

研究中提出的原始贡献包含在文章/补充材料;进一步询问可直接联系相应作者。

 

道德声明

涉及人类参与者的研究得到了青岛大学附属医院伦理委员会的审查和批准。患者/参与者提供了参与本研究的书面知情同意书。动物研究经青岛大学医学院伦理委员会审查批准。

 

作者贡献

M-JL 和 W-SS 操作了所有实验,分析了数据,并撰写了初稿。 Y-KZ分析了数据并写出了初稿。 YY分析了数据。 QL 分析并解释了动物的数据。 Y-ZG进行动物实验。 TY进行了动物实验。 D-MX - 审阅并编辑了手稿。所有作者阅读并认可的终稿。

 

资金

该研究得到了青岛市肿瘤医院资助机构和青岛市博士后应用研究项目(编号:RZ2100005362)的专项资助。

 

利益冲突

作者声明,该研究是在不存在任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

 

出版商备注

本文中表达的所有主张仅代表作者的主张,并不一定代表其附属组织或出版商、编辑和审稿人的主张。本文中可能评估的任何产品或其制造商可能提出的声明均未得到出版商的保证或认可。

 

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